JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
생화학

Identifisering av Inositol fosfat eller Fosfoinositid samspill proteiner av affinitet kromatografi koplet til Western Blot eller Mass massespektrometri

Published: July 26, 2019
doi:
10.3791/59865
1Institute of Parasitology,McGill University

Summary

Denne protokollen fokuserer på identifisering av proteiner som binder til Inositol fosfater eller phosphoinositides. Den bruker affinitet kromatografi med biotinylated Inositol fosfater eller phosphoinositides som er immobilisert via streptavidin til agarose eller magnetiske perler. Inositol fosfat eller fosfoinositid bindende proteiner identifiseres av vestlig blotting eller masse massespektrometri.

Abstract

Inositol fosfater og phosphoinositides regulerer flere cellulære prosesser i Landplantenes, inkludert genuttrykk, vesicle smugling, signal Transduction, metabolisme og utvikling. Disse metabolitter utføre denne regulatoriske aktiviteten ved binding til proteiner, og dermed endre protein konformasjon, katalysator og/eller interaksjoner. Metoden beskrevet her bruker affinitet kromatografi koplet til masse massespektrometri eller vestlige blotting å identifisere proteiner som samhandler med Inositol fosfater eller phosphoinositides. Inositol fosfater eller phosphoinositides er kjemisk merket med biotin, som deretter fanges via streptavidin bøyd til agarose eller magnetiske perler. Proteiner er isolert av deres affinitet av binding til metabolitten, deretter eluert og identifisert av masse massespektrometri eller vestlig blotting. Metoden har en enkel arbeidsflyt som er følsom, ikke-radioaktivt, liposome, og passelig, støtter analyse av protein og metabolitten interaksjon med presisjon. Denne tilnærmingen kan brukes i etikett-fri eller i amino acid-merket kvantitative masse massespektrometri metoder for å identifisere protein-metabolitten interaksjoner i komplekse biologiske prøver eller ved hjelp av renset proteiner. Denne protokollen er optimalisert for analyse av proteiner fra Trypanosoma brucei, men det kan tilpasses til relaterte protozoan parasitter, gjær eller pattedyrceller.

Introduction

Inositol fosfater (IPS) og phosphoinositides (PIs) spiller en sentral rolle i eukaryote biologi gjennom regulering av cellulære prosesser som kontroll av genuttrykk1,2,3, vesicle smugling 4, signal Transduction5,6, metabolisme7,8,9og utvikling8,10. Den regulatoriske funksjon av disse metabolitter resultater fra deres evne til å samhandle med proteiner og dermed regulere protein funksjon. Ved binding av proteiner, kan IPs og PIs endre protein konformasjon11, katalysatorer aktivitet12, eller interaksjoner13 og dermed påvirker mobilnettet funksjon. IPS og PIs distribueres i flere subcellulære rom, for eksempel nucleus2,3,14,15, endoplasmatiske retikulum16,17, plasma membran1 og stoffer18, enten forbundet med proteiner3,19 eller med RNAs20.

Kløften av membranen-assosiert PI (4, 5) P2 ved fosfolipase C resulterer i utgivelsen av ins (1, 4, 5) P3, som kan fosforylert eller dephosphorylated av IP kinaser og phosphatases, henholdsvis. IPs er løselige molekyler som kan bindes til proteiner og utøver regulatoriske funksjoner. For eksempel ins (1, 4, 5) P3 i metazoan kan fungere som en andre Messenger ved binding til IP3 reseptorer, som induserer reseptor conformational endringer og dermed utgivelsen av ca2 + fra intracellulære butikker11. Ins (1, 3, 4, 5) P4 binder seg til Histone deacetylase komplekse og regulerer protein kompleks montering og aktivitet13. Andre eksempler på IPS forskriftsmessig funksjon inkluderer kontroll av kromatin organisasjon21, RNA transport22,23, RNA redigering24, og transkripsjon1,2,3 . I kontrast, PIs er ofte forbundet med rekruttering av proteiner til plasma membranen eller organelle membraner25. Men en voksende egenskap av PIs er evnen til å assosiere med proteiner i et ikke-membranous miljø3,15,19,26. Dette er tilfelle av den kjernefysiske reseptor steroidogenic faktor, som transcriptional kontrollfunksjonen er regulert av PI (3, 4, 5) P319, og Poly-A polymerase som enzymatisk aktivitet er regulert av kjernefysiske PI (4, 5) P226. En regulerende rolle for IPS og PIs har blitt vist i mange organismer, inkludert gjær22,27, pattedyrceller19,23, Drosophila10 og Worms28. Av betydning er rollen til disse metabolitter i trypanosomes, som skilt tidlig fra eukaryote avstamning. Disse metabolitter spiller en viktig rolle i Trypanosoma brucei transcriptional kontroll1,3, utvikling8, organelle kognitiv og protein trafikk29,30 , 31 andre , 32, og er også involvert i å kontrollere utvikling og smitte i patogener T. cruzi33,34,35, Toxoplasma36 og Plasmodium 5 andre priser , 37. herav, forståelse rollen av IPS og PIs inne trypanosomes kanskje hjelpe å belyse ny Biological funksjonen for disse molekyler og å identifisere romersk bedøve mål.

Det spesielle ved protein og IP eller PI bindende avhenger protein samspill domener og fosforylering staten Inositol13,38, selv om interaksjoner med lipid delen av PIs oppstår også19. Variasjonen av IPs og PIs og deres modifisere kinaser og phosphatases gir en fleksibel cellulær mekanisme for å kontrollere protein funksjon som er påvirket av metabolitten tilgjengelighet og overflod, den fosforylering tilstanden til Inositol, og protein affinitet av samspill1,3,13,38. Selv om noen protein domener er godt preget39,40,41, f. eks, pleckstrin homologi domene42 og SPX (SYG1/Pho81/XPR1) domener43 ,44,45, noen proteiner samhandle med IPS eller PIs av mekanismer som forblir ukjent. For eksempel, hemmende-aktivator protein 1 (RAP1) av T. brucei mangler kanoniske PI-bindende domener, men SAMHANDLER med PI (3, 4, 5) P3 og kontroll transkripsjon av gener involvert i antigen variasjon3. Affinitet kromatografi og masse massespektrometri analyse av IP eller PI samhandler proteiner fra trypanosome, gjær eller pattedyrceller identifisert flere proteiner uten kjente IP-eller PI-bindende domener8,46, 47. dataene tyder på flere uncharacterized protein domener som binder til disse metabolitter. Derfor, identifisering av proteiner som samhandler med IP eller PIs kan avdekke romanen mekanismer av protein-metabolitten interaksjon og nye cellulære regulatoriske funksjoner for disse små molekyler.

Metoden beskrevet her sysselsetter affinitet kromatografi koplet til vestlige blotting eller masse massespektrometri å identifisere proteiner som binder til IPs eller PIs. Den bruker biotinylated IP-adresser eller behandlingsinstruksjoner som enten er krysskoblet til streptavidin som bøyes likt til agarose perler eller alternativt, tatt opp via streptavidin magnetiske perler (figur 1). Metoden gir en enkel arbeidsflyt som er følsom, ikke-radioaktivt, liposome og er egnet for å oppdage bindingen av proteiner fra celle lysater eller renset proteiner3 (figur 2). Metoden kan brukes i etikett-Free8,46 eller koplet til amino acid-merket kvantitative masse massespektrometri47 å identifisere IP eller PI-bindende proteiner fra komplekse biologiske prøver. Derfor er denne metoden et alternativ til de få metodene som er tilgjengelige for å studere samspillet av IPs eller PIs med cellulære proteiner og vil bidra til å forstå regulatoriske funksjon av disse metabolitter i trypanosomes og kanskje andre Landplantenes.

Protocol

1. analyse av IP-eller PI-bindende proteiner av affinitet kromatografi og vestlig blotting Cellevekst, lyse og affinitet kromatografi Grow T. brucei celler til midten av loggen fase og overvåke celle levedyktighet og tetthet. Totalt 5,0 x 107 celler er tilstrekkelig for en bindende analysen. For blodbanen former, vokse celler i HMI-9 Media supplert med 10% fosterets storfe serum (FBS) ved 37 ° c og 5% CO2. Hold celle tetthet mellom 8,0 x 10…

Representative Results

Analyse av RAP1 og PI (3, 4, 5) P3 interaksjon ved affinitet kromatografi og vestlig blottingDette eksemplet illustrerer anvendelsen av denne metoden for å analysere bindingen av PIs av RAP1 fra T. brucei lysat eller ved rekombinant t. brucei RAP1 protein. Lysater av T. brucei blodbanen former som uttrykker HEMAGGLUTININ (ha)-Tagged RAP1 ble brukt i bindende analyser. RAP1 er et protein som er involvert i transcriptional kontroll av variant overflaten glykoprotein (VSG) ge…

Discussion

Identifisering av proteiner som binder til IPs eller PIs er avgjørende for å forstå cellulære funksjon av disse metabolitter. Affinitet kromatografi koplet til Western Blot eller masse massespektrometri gir en mulighet til å identifisere IP eller PI samspill proteiner og dermed få innsikt i sin regulatoriske funksjon. IPs eller PIs kjemisk merket [f. eks ins (1, 4, 5) P3 kjemisk knyttet til biotin] og krysskoblet til agarose perler via streptavidin eller fanget av streptavidin magnetiske perler tillater isolering a…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av Natural Sciences og engineering Research Council of Canada (NSERC, RGPIN-2019-04658); NSERC Discovery lanseringen supplement for tidlig karriere forskere (DGECR-2019-00081) og ved McGill University.

Materials

Acetone Sigma-Aldrich 650501 Ketone
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004 Solvent 
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich A6141 Inorganic salt
Centrifuge Avanti J6-MI Beckman Coulter Avanti J6-MI Centrifuge for large volumes (e.g., 1L)
Centrifuge botles Sigma-Aldrich B1408 Bottles for centrifugation of 1L of culture
Control Beads Echelon P-B000-1ml Affinity chromatography reagent – control
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 Sugar, Added in PBS to keep cells viable
Dithiothreitol (DTT)  Bio-Rad 1610610 Reducing agent
Dynabeads M-270 Streptavidin ThermoFisher Scientific 65305 Streptavidin beads for binding to biotin ligands
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001 Protease inhibitors
Electrophoresis running buffer Bio-Rad 1610732 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning Life Sciences 430052 To centrifuge 10 mL cultures
Formic acid Sigma-Aldrich 106526 Acid
Glycine Sigma-Aldrich G7126 Amino acid
HMI-9 cell culture medium ThermoFisher Scientific ME110145P1 Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms
Imperial Protein Stain ThermoFisher Scientific 24615 Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE
Ins(1,4,5)P3 Beads Echelon Q-B0145-1ml Affinity chromatography reagent 
Instant Nonfat Dry Milk Thomas Scientific C837M64 Blocking reagent for Western blotting
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I6125 Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides
Lab Rotator Thomas Scientific 1159Z92 For binding assays
LoBind Microcentrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 13-698-793 Low protein binding tubes for mass spectrometry
Nonidet P-40 (Igepal CA-630) Sigma-Aldrich 21-3277 Detergent
PBS, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010031 Physiological buffer
Peroxidase substrate for chemiluminescence ThermoFisher Scientific 32106 Substrate for Western bloting detection of proteins
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets Roche 4906845001 Phosphatase inhibitors
PI(3)P PIP Beads Echelon P-B003a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4)P2 PIP Beads Echelon P-B034a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 diC8 Echelon P-3908-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 PIP Beads Echelon P-B345a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,5)P2 PIP Beads Echelon P-B035a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4)P PIP Beads Echelon P-B004a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 diC8 Echelon P-4508-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 PIP Beads Echelon P-B045a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(5)P PIP Beads Echelon P-B005a-1ml Affinity chromatography reagent 
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170 Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid)
Potassium hexacyanoferrate(III) Sigma-Aldrich 702587 Potassium salt 
PtdIns PIP Beads Echelon P-B001-1ml Affinity chromatography reagent 
PVDF Membrane Bio-Rad 1620177 For Western blotting 
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5910 R Microcentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL)
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich 862010 Detergent
Sodium thiosulfate Sigma-Aldrich 72049 Chemical 
SpeedVac Vacuum Concentrators ThermoFisher Scientific SPD120-115 Sample concentration (e.g., for mass spectrometry)
T175 flasks for cell culture  ThermoFisher Scientific 159910 To grow 50 mL T. brucei culture
Trypsin, Mass Spectrometry Grade Promega V5280 Trypsin for protein digestion
Urea Sigma-Aldrich U5128 Denaturing reagent
Vortex Fisher Scientific 02-215-418 For mixing reactions
Western blotting transfer buffer Bio-Rad 1610734 25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol
Whatman 3 mm paper Sigma-Aldrich WHA3030861 Paper for Wester transfer
2-mercaptoethanol (14.2 M) Bio-Rad 1610710 Reducing agent
2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0737 Protein loading buffer
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-Rad 4561094 Gel for protein electrophoresis
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0747 Protein loading buffer
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cestari, I., Stuart, K. Inositol phosphate pathway controls transcription of telomeric expression sites in trypanosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2803-2812 (2015).
  2. Odom, A. R., Stahlberg, A., Wente, S. R., York, J. D. A role for nuclear inositol 1,4,5-trisphosphate kinase in transcriptional control. Science. 287 (5460), 2026-2029 (2000).
  3. Cestari, I., McLeland-Wieser, H., Stuart, K. Nuclear Phosphatidylinositol 5-Phosphatase Is Essential for Allelic Exclusion of Variant Surface Glycoprotein Genes in Trypanosomes. Molecular and Cellular Biology. 39 (3), (2019).
  4. Billcliff, P. G., et al. OCRL1 engages with the F-BAR protein pacsin 2 to promote biogenesis of membrane-trafficking intermediates. Molecular Biology of the Cell. 27 (1), 90-107 (2016).
  5. Brochet, M., et al. Phosphoinositide metabolism links cGMP-dependent protein kinase G to essential Ca(2)(+) signals at key decision points in the life cycle of malaria parasites. PLoS Biology. 12 (3), 1001806 (2014).
  6. Azevedo, C., Szijgyarto, Z., Saiardi, A. The signaling role of inositol hexakisphosphate kinases (IP6Ks). Advances in Enzyme Regulation. 51 (1), 74-82 (2011).
  7. Szijgyarto, Z., Garedew, A., Azevedo, C., Saiardi, A. Influence of inositol pyrophosphates on cellular energy dynamics. Science. 334 (6057), 802-805 (2011).
  8. Cestari, I., Anupama, A., Stuart, K. Inositol polyphosphate multikinase regulation of Trypanosoma brucei life stage development. Molecular Biology of the Cell. 29 (9), 1137-1152 (2018).
  9. Bang, S., et al. AMP-activated protein kinase is physiologically regulated by inositol polyphosphate multikinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 616-620 (2012).
  10. Seeds, A. M., Tsui, M. M., Sunu, C., Spana, E. P., York, J. D. Inositol phosphate kinase 2 is required for imaginal disc development in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (51), 15660-15665 (2015).
  11. Hamada, K., Miyatake, H., Terauchi, A., Mikoshiba, K. IP3-mediated gating mechanism of the IP3 receptor revealed by mutagenesis and X-ray crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 4661-4666 (2017).
  12. Watson, P. J., et al. Insights into the activation mechanism of class I HDAC complexes by inositol phosphates. Nature Communications. 7, 11262 (2016).
  13. Watson, P. J., Fairall, L., Santos, G. M., Schwabe, J. W. Structure of HDAC3 bound to co-repressor and inositol tetraphosphate. Nature. 481 (7381), 335-340 (2012).
  14. Irvine, R. F. Nuclear lipid signalling. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 4 (5), 349-360 (2003).
  15. Sobol, M., et al. UBF complexes with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in nucleolar organizer regions regardless of ongoing RNA polymerase I activity. Nucleus. 4 (6), 478-486 (2013).
  16. Nascimbeni, A. C., et al. ER-plasma membrane contact sites contribute to autophagosome biogenesis by regulation of local PI3P synthesis. EMBO Journal. 36 (14), 2018-2033 (2017).
  17. Martin, K. L., Smith, T. K. The myo-inositol-1-phosphate synthase gene is essential in Trypanosoma brucei. Biochemical Society Transactions. 33, 983-985 (2005).
  18. Matsu-ura, T., et al. Cytosolic inositol 1,4,5-trisphosphate dynamics during intracellular calcium oscillations in living cells. Journal of Cell Biology. 173 (5), 755-765 (2006).
  19. Blind, R. D., et al. The signaling phospholipid PIP3 creates a new interaction surface on the nuclear receptor SF-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (42), 15054-15059 (2014).
  20. Lin, A., et al. The LINK-A lncRNA interacts with PtdIns(3,4,5)P3 to hyperactivate AKT and confer resistance to AKT inhibitors. Nature Cell Biology. 19 (3), 238-251 (2017).
  21. Steger, D. J., Haswell, E. S., Miller, A. L., Wente, S. R., O’Shea, E. K. Regulation of chromatin remodeling by inositol polyphosphates. Science. 299 (5603), 114-116 (2003).
  22. York, J. D., Odom, A. R., Murphy, R., Ives, E. B., Wente, S. R. A phospholipase C-dependent inositol polyphosphate kinase pathway required for efficient messenger RNA export. Science. 285 (5424), 96-100 (1999).
  23. Adams, R. L., Mason, A. C., Glass, L., Aditi, S. R., Wente, Nup42 and IP6 coordinate Gle1 stimulation of Dbp5/DDX19B for mRNA export in yeast and human cells. Traffic. 18 (12), 776-790 (2017).
  24. Macbeth, M. R., et al. Inositol hexakisphosphate is bound in the ADAR2 core and required for RNA editing. Science. 309 (5740), 1534-1539 (2005).
  25. Dickson, E. J., Hille, B. Understanding phosphoinositides: rare, dynamic, and essential membrane phospholipids. Biochemical Journal. 476 (1), 1-23 (2019).
  26. Mellman, D. L., et al. A PtdIns4,5P2-regulated nuclear poly(A) polymerase controls expression of select mRNAs. Nature. 451 (7181), 1013-1017 (2008).
  27. Lee, Y. S., Mulugu, S., York, J. D., O’Shea, E. K. Regulation of a cyclin-CDK-CDK inhibitor complex by inositol pyrophosphates. Science. 316 (5821), 109-112 (2007).
  28. Nagy, A. I., et al. IP3 signalling regulates exogenous RNAi in Caenorhabditis elegans. EMBO Reports. 16 (3), 341-350 (2015).
  29. Hall, B. S., et al. TbVps34, the trypanosome orthologue of Vps34, is required for Golgi complex segregation. Journal of Biological Chemistry. 281 (37), 27600-27612 (2006).
  30. Rodgers, M. J., Albanesi, J. P., Phillips, M. A. Phosphatidylinositol 4-kinase III-beta is required for Golgi maintenance and cytokinesis in Trypanosoma brucei. Eukaryotic Cell. 6 (7), 1108-1118 (2007).
  31. Gilden, J. K., et al. The role of the PI(3,5)P2 kinase TbFab1 in endo/lysosomal trafficking in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 214, 52-61 (2017).
  32. Demmel, L., et al. The endocytic activity of the flagellar pocket in Trypanosoma brucei is regulated by an adjacent phosphatidylinositol phosphate kinase. Journal of Cell Science. 129 (11), 2285 (2016).
  33. Gimenez, A. M., et al. Phosphatidylinositol kinase activities in Trypanosoma cruzi epimastigotes. Molecular and Biochemical Parasitology. 203 (1-2), 14-24 (2015).
  34. Hashimoto, M., et al. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor regulates replication, differentiation, infectivity and virulence of the parasitic protist Trypanosoma cruzi. Molecular Microbiology. 87 (6), 1133-1150 (2013).
  35. Cestari, I., Haas, P., Moretti, N. S., Schenkman, S., Stuart, K. Chemogenetic Characterization of Inositol Phosphate Metabolic Pathway Reveals Druggable Enzymes for Targeting Kinetoplastid Parasites. Cell Chemical Biology. 23 (5), 608-617 (2016).
  36. Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores. Journal of Biological Chemistry. 277 (29), 25870-25876 (2002).
  37. McNamara, C. W., et al. Targeting Plasmodium PI(4)K to eliminate malaria. Nature. 504 (7479), 248-253 (2013).
  38. Tresaugues, L., et al. Structural basis for phosphoinositide substrate recognition, catalysis, and membrane interactions in human inositol polyphosphate 5-phosphatases. Structure. 22 (5), 744-755 (2014).
  39. Varnai, P., et al. Quantifying lipid changes in various membrane compartments using lipid binding protein domains. Cell Calcium. 64, 72-82 (2017).
  40. Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Letters. 590 (15), 2454-2468 (2016).
  41. Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains–their role in signalling and membrane trafficking. Current Biology. 11 (21), 882-893 (2001).
  42. Klarlund, J. K., et al. Signaling by phosphoinositide-3,4,5-trisphosphate through proteins containing pleckstrin and Sec7 homology domains. Science. 275 (5308), 1927-1930 (1997).
  43. Wild, R., et al. Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains. Science. 352 (6288), 986-990 (2016).
  44. Gerasimaite, R., et al. Inositol Pyrophosphate Specificity of the SPX-Dependent Polyphosphate Polymerase VTC. ACS Chemical Biology. 12 (3), 648-653 (2017).
  45. Potapenko, E., et al. 5-Diphosphoinositol pentakisphosphate (5-IP7) regulates phosphate release from acidocalcisomes and yeast vacuoles. Journal of Biological Chemistry. 293 (49), 19101-19112 (2018).
  46. Wu, M., Chong, L. S., Perlman, D. H., Resnick, A. C., Fiedler, D. Inositol polyphosphates intersect with signaling and metabolic networks via two distinct mechanisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6757-6765 (2016).
  47. Jungmichel, S., et al. Specificity and commonality of the phosphoinositide-binding proteome analyzed by quantitative mass spectrometry. Cell Reports. 6 (3), 578-591 (2014).
  48. Yang, X., Figueiredo, L. M., Espinal, A., Okubo, E., Li, B. RAP1 is essential for silencing telomeric variant surface glycoprotein genes in Trypanosoma brucei. Cell. 137 (1), 99-109 (2009).
  49. Cestari, I., Stuart, K. Transcriptional Regulation of Telomeric Expression Sites and Antigenic Variation in Trypanosomes. Current Genomics. 19 (2), 119-132 (2018).
  50. Clough, T., Thaminy, S., Ragg, S., Aebersold, R., Vitek, O. Statistical protein quantification and significance analysis in label-free LC-MS experiments with complex designs. BMC Bioinformatics. 13, 6 (2012).
  51. Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei. Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).
  52. DeGrasse, J. A., Chait, B. T., Field, M. C., Rout, M. P. High-yield isolation and subcellular proteomic characterization of nuclear and subnuclear structures from trypanosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 77-92 (2008).
  53. Opperdoes, F. R. A rapid method for the isolation of intact glycosomes from Trypanosoma brucei by Percoll -gradient centrifugation in a vertical rotor. Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (3), 181-186 (1981).
  54. Pereira, N. M., de Souza, W., Machado, R. D., de Castro, F. T. Isolation and properties of flagella of trypanosomatids. The Journal of protozoology. 24 (4), 511-514 (1977).
  55. Subota, I., et al. Proteomic analysis of intact flagella of procyclic Trypanosoma brucei cells identifies novel flagellar proteins with unique sub-localization and dynamics. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (7), 1769-1786 (2014).
  56. Fukuda, M., Kojima, T., Kabayama, H., Mikoshiba, K. Mutation of the pleckstrin homology domain of Bruton’s tyrosine kinase in immunodeficiency impaired inositol 1,3,4,5-tetrakisphosphate binding capacity. Journal of Biological Chemistry. 271 (48), 30303-30306 (1996).
  57. Knodler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. BioTechniques. 38 (6), (2005).
  58. Best, M. D. Global approaches for the elucidation of phosphoinositide-binding proteins. Chemistry and Physics of Lipids. 182, 19-28 (2014).

Tags

Inositol PhosphatePhosphoinositideProtein BindingAffinity ChromatographyWestern BlotMass SpectrometryRegulatory FunctionSignal TransductionCell DevelopmentBiotinylatedLyposome FreeT. BruceiPBS-GLysis BufferProtease InhibitorPhosphatase InhibitorBinding Assay
check_url/kr/59865?article_type=t&slug=identification-inositol-phosphate-or-phosphoinositide-interacting

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Cestari, I. Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (149), e59865, doi:10.3791/59865 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image