이 프로토콜은 이노 시 톨 인산 염 또는 인산 염에 바인딩하는 단백질의 식별에 초점을 맞추고. 그것은 아가로스 또는 자기 구슬에 streptavidin을 통해 고정되는 생물이노시톨 인산염 또는 인산화물과 친화성 크로마토그래피를 사용합니다. 이노시톨 인산염 또는 인산화결합 단백질은 서양 블로팅 또는 질량 분석법에 의해 확인된다.
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방법 논문
이노시톨 인산염 또는 인산성교단백질의 동정은 서부 블롯 또는 질량분광법에 결합된 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질
이 논문에서
요약
초록
이노시톨 인산염과 인산화효소는 진핵생물의 여러 세포 과정을 조절하며, 유전자 발현, 소포 인신매매, 신호 전염, 대사 및 발달을 포함합니다. 이 대사 산물은 단백질에 결합하여 이 규정하는 활동을 능력을 발휘합니다, 그로 단백질 형태, 촉매 활동 및/또는 상호 작용을 변경합니다. 여기에서 기술한 방법은 질량 분광법 또는 서쪽 blotting에 결합된 친화성 크로마토그래피를 사용하여 이노시톨 인산염 또는 인산화물과 상호 작용하는 단백질을 확인합니다. 이노시톨 인산염 또는 인산화물은 화학적으로 비오틴으로 태그가 지정되어 있으며, 이 제품은 아가로오스 또는 자기 구슬에 결합된 스트렙타비딘을 통해 포획됩니다. 단백질은 대사 산물에 결합하는 그들의 친화력에 의해 단리되고, 그 후 질량 분석법 또는 서쪽 얼룩에 의해 용출되고 확인됩니다. 이 방법은 민감하고 비방사성, 리포솜이 없고 사용자 정의 할 수있는 간단한 워크플로우를 가지고 있으며 단백질 및 대사 산물 상호 작용의 정밀도 분석을 지원합니다. 이 접근법은 복잡한 생물학적 샘플에서 단백질 대사 산물 상호 작용을 식별하거나 정제 된 단백질을 사용하는 아미노산 라벨이 붙은 정량질량 분석법에서 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 Trypanosoma brucei에서단백질의 분석을 위해 최적화되어 있지만, 관련 원생 동물 기생충, 효모 또는 포유류 세포에 적응될 수 있다.
서론
이노시톨 인산염(IP) 및 인산염(PIs)은 유전자 발현 1,2,3,소포 인신매매 등의 세포 과정의 조절을 통해 진핵생물 생물학에 중심적인 역할을 한다. 4, 신호 변환5,6, 신진 대사7,8,9, 개발8,10. 이 대사 산물의 규정 하는 기능은 단백질과 상호 작용 하 고 따라서 단백질 기능을 조절 하는 그들의 능력에서 발생. 단백질에 의해 결합하는 경우에, IP 및 PIs는 단백질 형태11,촉매 활동12,또는 상호 작용13를 바꿀 수 있고 그러므로 세포 기능에 영향을 미칩니다. IP ....
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프로토콜
1. 친화성 크로마토그래피 및 웨스턴 블로팅에 의한 IP- 또는 PI 결합 단백질 분석
- 세포 성장, 포해 및 친화성 크로마토그래피
- T. 브루시 세포를 중간 로그 단계로 성장시키고 세포 생존 가능성과 밀도를 모니터링합니다. 총 5.0 x 107 세포는 하나의 결합 분석에 충분하다.
- 혈류 형태를 위해, HMI-9 매체에 있는 세포를 37°C 및 5% CO2에서 10% 태아소 혈청 (FBS)로 보충합니다. 셀 밀도를 8.0 x 105 ~ 1.6 x 106 셀/mL 사이로 유지합니다.
참고: 1.8 x 106 셀/mL보다 높은 밀도는 세포 생존에 영향을 줄 수 있습니다. 시험관 내에서 성장된 T. brucei 427 균주의 두 배 시간은 5.5 및 6.5 시간 사이입니다. - procyclic 형태의 경우, 27 °C에서 10 % FBS로 보충 된 SDM-79 배지에서 세포를 성장시키고 세포 밀도를 1.0 x 107 및 3.0 x 107 세포 / mL 사이로 유지하십시오.
- 정제 된 단백질 (예를 들어, 재조합 ....
- 혈류 형태를 위해, HMI-9 매체에 있는 세포를 37°C 및 5% CO2에서 10% 태아소 혈청 (FBS)로 보충합니다. 셀 밀도를 8.0 x 105 ~ 1.6 x 106 셀/mL 사이로 유지합니다.
- T. 브루시 세포를 중간 로그 단계로 성장시키고 세포 생존 가능성과 밀도를 모니터링합니다. 총 5.0 x 107 세포는 하나의 결합 분석에 충분하다.
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결과
RAP1 및 PI 분석 (3,4,5)친화성 크로마토그래피 및 웨스턴 블로팅에 의한 P3 상호 작용
이 예는 T. brucei 용해또는 재조합 T. brucei RAP1 단백질에 의해 RAP1에 의한 PI의 결합을 분석하기 위한 이 방법의 적용을 예시한다. Hemagglutinin (HA)태그 RAP1를 발현하는 T. brucei 혈류 량 형태의 Lysates 결합 검정에서 사용 되었다. RAP1은 변이체 표면 당단백질(VSG) 유전자의 전사조절에 관여하는 단백질로,48,이는 항원 변이에 의한 기생충 면역 회피에 관여하는 표면 단백질을 인코딩하는49. RAP1은 포스파티딜리노시톨 5-포스파타제(PIP5Pase) 효소3과텔로메릭 단백질 복합체 내에서 상호 작용하.......
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토론
IP 또는 PIs에 결합하는 단백질의 확인은 이 대사 산물의 세포 기능을 이해하는 것이 중요합니다. 서양 얼룩 또는 질량 분석법에 결합된 친화성 크로마토그래피는 IP 또는 PI 상호 작용 단백질을 식별하고 따라서 그들의 규제 기능에 대한 통찰력을 얻을 수있는 기회를 제공합니다. IP 또는 IP는 화학적으로 태그 [예를 들어, Ins (1,4,5)P3는 화학적으로 비오틴에 연결] 스트렙타비딘을 통해 아가로즈 구슬에 가교 또는 스트렙타비딘 자기 비드에 의해 캡처 된 다음 질량으로 식별 할 수있는 상호 작용 단백질의 분리를 허용 분광법 또는 서부 얼룩. 여기에서 기술된 프로토콜은 이 대사산물에 묶는 T. brucei3,8 및 포유류 세포47에서 단백질을 확인하기 위하여 이용되었습니다. 맞춤형 태그(비오틴 제외)를 사용하는 접근법의 변형도 효모
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구위원회에 의해 지원되었다 (NSERC, RGPIN-2019-04658); 초기 경력 연구원을위한 NSERC 디스커버리 출시 보충 (DGECR-2019-00081) 및 맥길 대학에 의해.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아세톤 | Sigma-Aldrich | 650501 | Ketone |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | 용매 |
| 암모늄 바이카보네이 | Sigma-Aldrich | A6141 | 무기염 |
| 원심분리기 Avanti J6-MI | Beckman Coulter | Avanti J6-MI | 대용량용 원심분리기(예: 1L) |
| 원심분리기 botles | Sigma-Aldrich | B1408 | 1L 배양 원심분리용 병 |
| Control Beads | Echelon | P-B000-1ml | 친화성 크로마토그래피 시약 - control |
| D-(+)-포도 | 시그마-알드리치 | G8270 | 설탕, 세포를 생존 가능하게 유지하기 위해 PBS에 첨가 |
| 디티오트레이톨 (DTT) | Bio-Rad | 1610610 | 환원제 |
| Dynabeads M-270 Streptavidin | ThermoFisher Scientific | 65305 | 비오틴 리간드에 결합하기 위한 Streptavidin 비드 |
| EDTA 무함유 프로테아제 억제제 칵테일 | Roche | 11836170001 | 프로테아제 억제제 |
| 전기영동 러닝 버퍼 | Bio-Rad | 1610732 | 25 mM Tris, 192 mM 글리신, 0.1% SDS, pH 8.3 |
| Falcon 15 mL 원뿔형 원심분리기 튜브 | Corning Life Sciences | 430052 | 10 mL 배양을 원심분리하려면 |
| 포름산 | Sigma-Aldrich | 106526 | 산 |
| 성 글리신 | Sigma-Aldrich | G7126 | 아미노산 |
| HMI-9 세포 배양 배지 | ThermoFisher Scientific | ME110145P1< | em>T. brucei 혈류 형태 |
| 를 위한 세포 배양 배지Imperial Protein Stain | ThermoFisher Scientific | 24615 | Coomassie 염색으로 SDS/PAGE |
| Ins(1,4,5)P3 Beads에서 | Echelon | Q-B0145-1ml | 친화성 크로마토그래피 시약 |
| 즉시 무지방 건조 Milk | Thomas Scientific | C837M64 | 웨스턴 블로팅 |
| 요오드아세트아미드 | Sigma-Aldrich | I6125 | 시스테인 단백질 또는 펩타이드용 알킬화 시약 |
| Lab Rotator | Thomas Scientific | 1159Z92 | 결합 분석용 |
| LoBind 마이크로 원심분리기 튜브 | ThermoFisher Scientific | 13-698-793 | 저단백질 결합 튜브 질량 분석용 |
| Nonidet P-40 (Igepal CA-630) | Sigma-Aldrich | 21-3277 | 세제 |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010031 | 생리학적 완충액 |
| 과산화효소 기질 | ThermoFisher Scientific | 32106 | 단백질의 웨스턴 블로팅 검출을 위한 기질 |
| PhosSTOP 인산가수분해효소 억제제 칵테일 정제 | Roche | 4906845001 | 인산가수분해효소 억제제 |
| PI(3)P PIP 비드 | Echelon | P-B003A-1ml | 친화성 크로마토그래피 시약 |
| PI(3,4)P2 PIP 비드 | Echelon | P-B034A-1ml | 친화성 크로마토그래피 시약 |
| PI(3,4,5)P3 diC8 | Echelon | P-3908-1mg | 친화성 크로마토그래피 시약 |
| PI(3,4,5)P3 PIP 비드 | Echelon | P-B345A-1ml | 친화성 크로마토그래피 시약 |
| PI(3,5)P2 PIP 비드 | Echelon | P-B035A-1ml | 친화성 크로마토그래피 시약 |
| PI(4)P PIP 비즈 | Echelon | P-B004A-1ml | 친화성 크로마토그래피 시약 |
| PI(4,5)P2 diC8 | Echelon | P-4508-1mg | 친화성 크로마토그래피 시약 |
| PI(4,5)P2 PIP 비드 | Echelon | P-B045A-1ml | 친화성 크로마토그래피 시약 |
| PI(5)P PIP 비즈 | Echelon | P-B005A-1ml | 친화성 크로마토그래피 시약 |
| Ponceau S 용액 | Sigma-Aldrich | P7170 | 단백질 염색 (0.1% [w/v] in 5% acetic acid) |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Sigma-Aldrich | 702587 | Potassium salt |
| PtdIns PIP 비즈 | Echelon | P-B001-1ml | 친화성 크로마토그래피 시약 |
| PVDF 멤브레인 | Bio-Rad | 1620177 | 웨스턴 블로팅용 |
| 냉장 원심분리기 | Eppendorf | 5910 R | 마이크로 원심분리기 작은 용량 (예: 1.5 mL) |
| 용 소듐 도데실 설페이트 | Sigma-Aldrich | 862010 | 세제 |
| 소듐 티오설페이트 | Sigma-Aldrich | 72049 | 화학 |
| SpeedVac 진공 농축기 | ThermoFisher Scientific | SPD120-115 | 시료 농도 (예: 질량 분석용) |
| 세포 배양을 위한 T175 플라스크; | ThermoFisher Scientific | 159910 | 50 mL T. brucei 배양 |
| 트립신, 질량 분석기 등급 | Promega | V5280 | 단백질 분해를 위한 트립신 |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5128 | 변성 시약 |
| Vortex | Fisher Scientific | 02-215-418 | 혼합 반응용 |
| Western blotting transfer buffer | Bio-Rad | 1610734 25 mM Tris, 192 mM 글리신, pH 8.3, 20% 메탄올 Whatman | |
| 3mm 종이 | Sigma-Aldrich | WHA3030861 | Paper for Wester transfer |
| 2-mercaptoethanol (14.2 M) | Bio-Rad | 1610710 | 환원제 |
| 2x Laemmli 샘플 버퍼 | Bio-Rad | 161-0737 | 단백질 로딩 버퍼 |
| 4– 20% 미니-프로테안 TGX 프리 캐스트 단백질 겔 | 전기 영동을위한 | Bio-Rad | 4561094 |
| 4x Laemmli 샘플 버퍼 | Bio-Rad | 161-0747 | 단백질 로딩 버퍼 |
참고문헌
- Cestari, I., Stuart, K. Inositol phosphate pathway controls transcription of telomeric expression sites in trypanosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2803-2812 (2015).
- Odom, A. R., Stahlberg, A., Wente, S. R., York, J. D.
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재인쇄 및 허가
