JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생화학

Identifiering av inositol fosfat eller fosfoinositid samverkande proteiner genom affinitetskromatografi kopplad till Western blot eller masspektrometri

Published: July 26, 2019
doi:
10.3791/59865
1Institute of Parasitology,McGill University

Summary

Detta protokoll fokuserar på identifiering av proteiner som binder till inositol fosfater eller phosphoinositides. Den använder affinitetskromatografi med biotinylerade inositol fosfater eller phosphoinositides som immobiliseras via konjugerat till aguppstod eller magnetiska pärlor. Inositol fosfat eller fosfoinositid bindande proteiner identifieras genom Western blotting eller masspektrometri.

Abstract

Inositol fosfater och phosphoinositides reglera flera cellulära processer i eukaryotes, inklusive genuttryck, vesikel trafficking, signaltransduktion, metabolism, och utveckling. Dessa metaboliter utföra denna reglerande aktivitet genom bindning till proteiner, därmed förändrade protein konformation, katalytisk aktivitet, och/eller interaktioner. Den metod som beskrivs här använder affinitetskromatografi kopplad till masspektrometri eller Western blotting att identifiera proteiner som interagerar med inositol fosfater eller phosphoinositides. Inositol fosfater eller phosphoinositides är kemiskt märkta med biotin, som sedan fångas via konjugerat konjugerat till aguppstod eller magnetiska pärlor. Proteiner isoleras genom sin affinitet av bindning till metaboliten, sedan eluerade och identifieras genom masspektrometri eller Western blotting. Metoden har ett enkelt arbetsflöde som är känsligt, icke-radioaktivt, Liposome-fritt, och anpassningsbara, stödja analys av protein och metabolit interaktion med precision. Denna metod kan användas i etikettfri eller i aminosyremärkta kvantitativa masspektrometrimetoder för att identifiera interaktioner med proteinmetabolit i komplexa biologiska prover eller med hjälp av renade proteiner. Detta protokoll är optimerat för analys av proteiner från Trypanosoma rhodesiense, men det kan anpassas till relaterade protozoer parasiter, jäst eller däggdjursceller.

Introduction

Inositol fosfater (IPS) och phosphoinositides (Pis) spelar en central roll i eukaryotebiologi genom regleringen av cellulära processer såsom kontroll av genuttryck1,2,3, vesikel trafficking 4, signaltransduktion5,6, metabolism7,8,9, och utveckling8,10. Reglerande funktion av dessa metaboliter resulterar från deras förmåga att interagera med proteiner och därmed reglera proteinfunktion. Vid bindning av proteiner, IPs och PIs kan förändra protein konformation11, katalytisk aktivitet12, eller interaktioner13 och därmed påverka cellulär funktion. IPS och Pis distribueras i flera subcellulära fack, såsom Nucleus2,3,14,15, endoplasmatiska Retikulum16,17, plasma membran1 och Cytosol18, antingen associerat med proteiner3,19 eller med rnas20.

Klyvning av membran-associerade PI (4,5) P2 av fosfolipas C resulterar i frisättning av ins (1, 4, 5) P3, som kan fosforyleras eller defosforyleras genom IP-kinaser respektive fosfataser. IPs är lösliga molekyler som kan binda till proteiner och utöva reglerande funktioner. Till exempel, ins (1, 4, 5) P3 i metazoan kan fungera som en andra budbärare genom bindning till IP3-receptorer, som inducerar receptor överensstämmelser förändringar och därmed frisättning av ca2 + från intracellulära butiker11. Ins (1, 3, 4, 5) P4 binder till histondeacetylase-komplexet och reglerar proteinkomplex montering och aktivitet13. Andra exempel på IPS reglerande funktion omfattar kontroll av kromatin organisation21, RNA transport22,23, RNA redigering24, och transkription1,2,3 . Däremot är PIs ofta förknippade med rekrytering av proteiner till plasmamembranet eller organell membran25. En framväxande egenskap hos Pis är dock förmågan att associera med proteiner i en icke-membranös miljö3,15,19,26. Detta är fallet med den nukleära receptorn steroidogena Factor, som transkriptionella kontrollfunktion regleras av PI (3, 4, 5) P319, och Poly-A polymeras som enzymatisk aktivitet regleras av kärn-PI (4,5) P226. En reglerande roll för IPS och Pis har visats i många organismer, inklusive jäst22,27, däggdjursceller19,23, Drosophila10 och Worms28. Av betydelse är den roll som dessa metaboliter i trypanosomes, som divergerat tidigt från eukaryotiska härstamning. Dessa metaboliter spelar en viktig roll i Trypanosoma rhodesiense transkriptionella kontroll1,3, utveckling8, organell biogenes och protein trafik29,30 , 31 , 32, och är också involverade i att kontrollera utveckling och infektion i patogenerna T. cruzi33,34,35, Toxoplasma36 och Plasmodium ,5 , 37. att förstå betydelsen av IPS och Pis i innebörder kan därför bidra till att belysa ny biologisk funktion för dessa molekyler och identifiera nya läkemedelsmål.

Specificiteten hos protein och IP eller PI bindning beror på protein samverkande domäner och fosforylering tillstånd av inositol13,38, även interaktioner med lipiddelen av Pis förekommer också19. Mångfalden av IPs och PIs och deras modifiera kinaser och fosfataser ger en flexibel cellulär mekanism för att kontrollera proteinfunktion som påverkas av metabolit tillgänglighet och överflöd, den fosforylering tillstånd av inositol, och protein interaktion1,3,13,38. Även om vissa protein domäner är väl kännetecknas39,40,41, t. ex., pleckstrin homologi domän42 och SPX (SYG1/Pho81/XPR1) domäner43 ,44,45, vissa proteiner interagerar med IPS eller Pis genom mekanismer som förblir okända. Till exempel, den repressor-Activator protein 1 (RAP1) av T. rhodesiense saknar kanoniska PI-bindande domäner men interagerar med PI (3, 4, 5) P3 och kontrollera transkription av gener inblandade i antigen variation3. Affinitetskromatografi och masspektrometri analys av IP-eller PI-interagerande proteiner från trypanosome, jäst eller däggdjursceller identifierade flera proteiner utan kända IP-eller PI-bindande domäner8,46, 47. data tyder på ytterligare okarakteriserade protein domäner som binder till dessa metaboliter. Därför kan identifieringen av proteiner som interagerar med IPs eller PIs avslöja nya mekanismer för interaktion med proteinmetabolit och nya cellulära reglerande funktioner för dessa små molekyler.

Den metod som beskrivs här använder affinitetskromatografi kopplad till västerländsk blotting eller masspektrometri för att identifiera proteiner som binder till IPs eller PIs. Den använder biotinylerade IPS eller Pis som är antingen tvärbunden till konjugerat konjugerat till agarpärlor eller alternativt, fångas via konjugerat-konjugerade magnetiska pärlor (figur 1). Metoden ger ett enkelt arbetsflöde som är känsligt, icke-radioaktivt, Liposome-fritt och lämpar sig för att detektera bindningen av proteiner från cell celllysat eller renade proteiner3 (figur 2). Metoden kan användas i etikettfria8,46 eller kopplad till aminosyramärkt kvantitativ masspektrometri47 för att identifiera IP-eller PI-bindande proteiner från komplexa biologiska prover. Därför är denna metod ett alternativ till de få metoder som finns för att studera samspelet mellan IPS eller Pis med cellulära proteiner och kommer att bidra till att förstå reglerande funktion av dessa metaboliter i innebörder och kanske andra eukaryotes.

Protocol

1. analys av IP-eller PI-bindande proteiner genom affinitetskromatografi och Western blotting Cell tillväxt, lys-och affinitetskromatografi Odla T. rhodesiense celler till mitten av log fas och övervaka cellernas lönsamhet och densitet. Totalt 5,0 x 107 celler räcker för en bindande analys. För blodomloppet former, växa celler i HMI-9 Media kompletteras med 10% foster bovin serum (FBS) vid 37 ° c och 5% CO2. Behåll CELLTÄTHETEN mellan 8,…

Representative Results

Analys av RAP1 och PI (3, 4, 5) P3 interaktion genom affinitetskromatografi och Western blottingDetta exempel illustrerar tillämpningen av denna metod för att analysera bindningen av Pis genom RAP1 från t. rhodesiense lysate eller med rekombinant t. rhodesiense RAP1 protein. Lysates av T. rhodesiense blodomloppet bildar det uttryckligt hemagglutinin (ha)-märkta RAP1 användes i bindande analyser. RAP1 är ett protein som deltar i transkriptionell kontroll av variant yta…

Discussion

Identifieringen av proteiner som binder till IPs eller PIs är avgörande för att förstå den cellulära funktionen av dessa metaboliter. Affinitetskromatografi kopplad till Western blot eller masspektrometri erbjuder en möjlighet att identifiera IP-eller PI-samverkande proteiner och därmed få insikter om deras reglerande funktion. IPS eller Pis kemiskt märkta [t. ex., ins (1, 4, 5) P3 kemiskt kopplad till biotin] och tvärbunden till Agros pärlor via konjugerat eller fångas av konjugerat magnetiska pärlor till?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av naturvetenskapliga och tekniska forskningsrådet i Kanada (NSERC, RGPIN-2019-04658); NSERC Discovery lansering tillägg för tidiga karriär forskare (DGECR-2019-00081) och av McGill University.

Materials

Acetone Sigma-Aldrich 650501 Ketone
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004 Solvent 
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich A6141 Inorganic salt
Centrifuge Avanti J6-MI Beckman Coulter Avanti J6-MI Centrifuge for large volumes (e.g., 1L)
Centrifuge botles Sigma-Aldrich B1408 Bottles for centrifugation of 1L of culture
Control Beads Echelon P-B000-1ml Affinity chromatography reagent – control
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 Sugar, Added in PBS to keep cells viable
Dithiothreitol (DTT)  Bio-Rad 1610610 Reducing agent
Dynabeads M-270 Streptavidin ThermoFisher Scientific 65305 Streptavidin beads for binding to biotin ligands
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001 Protease inhibitors
Electrophoresis running buffer Bio-Rad 1610732 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning Life Sciences 430052 To centrifuge 10 mL cultures
Formic acid Sigma-Aldrich 106526 Acid
Glycine Sigma-Aldrich G7126 Amino acid
HMI-9 cell culture medium ThermoFisher Scientific ME110145P1 Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms
Imperial Protein Stain ThermoFisher Scientific 24615 Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE
Ins(1,4,5)P3 Beads Echelon Q-B0145-1ml Affinity chromatography reagent 
Instant Nonfat Dry Milk Thomas Scientific C837M64 Blocking reagent for Western blotting
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I6125 Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides
Lab Rotator Thomas Scientific 1159Z92 For binding assays
LoBind Microcentrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 13-698-793 Low protein binding tubes for mass spectrometry
Nonidet P-40 (Igepal CA-630) Sigma-Aldrich 21-3277 Detergent
PBS, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010031 Physiological buffer
Peroxidase substrate for chemiluminescence ThermoFisher Scientific 32106 Substrate for Western bloting detection of proteins
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets Roche 4906845001 Phosphatase inhibitors
PI(3)P PIP Beads Echelon P-B003a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4)P2 PIP Beads Echelon P-B034a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 diC8 Echelon P-3908-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 PIP Beads Echelon P-B345a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,5)P2 PIP Beads Echelon P-B035a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4)P PIP Beads Echelon P-B004a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 diC8 Echelon P-4508-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 PIP Beads Echelon P-B045a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(5)P PIP Beads Echelon P-B005a-1ml Affinity chromatography reagent 
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170 Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid)
Potassium hexacyanoferrate(III) Sigma-Aldrich 702587 Potassium salt 
PtdIns PIP Beads Echelon P-B001-1ml Affinity chromatography reagent 
PVDF Membrane Bio-Rad 1620177 For Western blotting 
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5910 R Microcentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL)
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich 862010 Detergent
Sodium thiosulfate Sigma-Aldrich 72049 Chemical 
SpeedVac Vacuum Concentrators ThermoFisher Scientific SPD120-115 Sample concentration (e.g., for mass spectrometry)
T175 flasks for cell culture  ThermoFisher Scientific 159910 To grow 50 mL T. brucei culture
Trypsin, Mass Spectrometry Grade Promega V5280 Trypsin for protein digestion
Urea Sigma-Aldrich U5128 Denaturing reagent
Vortex Fisher Scientific 02-215-418 For mixing reactions
Western blotting transfer buffer Bio-Rad 1610734 25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol
Whatman 3 mm paper Sigma-Aldrich WHA3030861 Paper for Wester transfer
2-mercaptoethanol (14.2 M) Bio-Rad 1610710 Reducing agent
2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0737 Protein loading buffer
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-Rad 4561094 Gel for protein electrophoresis
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0747 Protein loading buffer
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cestari, I., Stuart, K. Inositol phosphate pathway controls transcription of telomeric expression sites in trypanosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2803-2812 (2015).
  2. Odom, A. R., Stahlberg, A., Wente, S. R., York, J. D. A role for nuclear inositol 1,4,5-trisphosphate kinase in transcriptional control. Science. 287 (5460), 2026-2029 (2000).
  3. Cestari, I., McLeland-Wieser, H., Stuart, K. Nuclear Phosphatidylinositol 5-Phosphatase Is Essential for Allelic Exclusion of Variant Surface Glycoprotein Genes in Trypanosomes. Molecular and Cellular Biology. 39 (3), (2019).
  4. Billcliff, P. G., et al. OCRL1 engages with the F-BAR protein pacsin 2 to promote biogenesis of membrane-trafficking intermediates. Molecular Biology of the Cell. 27 (1), 90-107 (2016).
  5. Brochet, M., et al. Phosphoinositide metabolism links cGMP-dependent protein kinase G to essential Ca(2)(+) signals at key decision points in the life cycle of malaria parasites. PLoS Biology. 12 (3), 1001806 (2014).
  6. Azevedo, C., Szijgyarto, Z., Saiardi, A. The signaling role of inositol hexakisphosphate kinases (IP6Ks). Advances in Enzyme Regulation. 51 (1), 74-82 (2011).
  7. Szijgyarto, Z., Garedew, A., Azevedo, C., Saiardi, A. Influence of inositol pyrophosphates on cellular energy dynamics. Science. 334 (6057), 802-805 (2011).
  8. Cestari, I., Anupama, A., Stuart, K. Inositol polyphosphate multikinase regulation of Trypanosoma brucei life stage development. Molecular Biology of the Cell. 29 (9), 1137-1152 (2018).
  9. Bang, S., et al. AMP-activated protein kinase is physiologically regulated by inositol polyphosphate multikinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 616-620 (2012).
  10. Seeds, A. M., Tsui, M. M., Sunu, C., Spana, E. P., York, J. D. Inositol phosphate kinase 2 is required for imaginal disc development in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (51), 15660-15665 (2015).
  11. Hamada, K., Miyatake, H., Terauchi, A., Mikoshiba, K. IP3-mediated gating mechanism of the IP3 receptor revealed by mutagenesis and X-ray crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 4661-4666 (2017).
  12. Watson, P. J., et al. Insights into the activation mechanism of class I HDAC complexes by inositol phosphates. Nature Communications. 7, 11262 (2016).
  13. Watson, P. J., Fairall, L., Santos, G. M., Schwabe, J. W. Structure of HDAC3 bound to co-repressor and inositol tetraphosphate. Nature. 481 (7381), 335-340 (2012).
  14. Irvine, R. F. Nuclear lipid signalling. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 4 (5), 349-360 (2003).
  15. Sobol, M., et al. UBF complexes with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in nucleolar organizer regions regardless of ongoing RNA polymerase I activity. Nucleus. 4 (6), 478-486 (2013).
  16. Nascimbeni, A. C., et al. ER-plasma membrane contact sites contribute to autophagosome biogenesis by regulation of local PI3P synthesis. EMBO Journal. 36 (14), 2018-2033 (2017).
  17. Martin, K. L., Smith, T. K. The myo-inositol-1-phosphate synthase gene is essential in Trypanosoma brucei. Biochemical Society Transactions. 33, 983-985 (2005).
  18. Matsu-ura, T., et al. Cytosolic inositol 1,4,5-trisphosphate dynamics during intracellular calcium oscillations in living cells. Journal of Cell Biology. 173 (5), 755-765 (2006).
  19. Blind, R. D., et al. The signaling phospholipid PIP3 creates a new interaction surface on the nuclear receptor SF-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (42), 15054-15059 (2014).
  20. Lin, A., et al. The LINK-A lncRNA interacts with PtdIns(3,4,5)P3 to hyperactivate AKT and confer resistance to AKT inhibitors. Nature Cell Biology. 19 (3), 238-251 (2017).
  21. Steger, D. J., Haswell, E. S., Miller, A. L., Wente, S. R., O’Shea, E. K. Regulation of chromatin remodeling by inositol polyphosphates. Science. 299 (5603), 114-116 (2003).
  22. York, J. D., Odom, A. R., Murphy, R., Ives, E. B., Wente, S. R. A phospholipase C-dependent inositol polyphosphate kinase pathway required for efficient messenger RNA export. Science. 285 (5424), 96-100 (1999).
  23. Adams, R. L., Mason, A. C., Glass, L., Aditi, S. R., Wente, Nup42 and IP6 coordinate Gle1 stimulation of Dbp5/DDX19B for mRNA export in yeast and human cells. Traffic. 18 (12), 776-790 (2017).
  24. Macbeth, M. R., et al. Inositol hexakisphosphate is bound in the ADAR2 core and required for RNA editing. Science. 309 (5740), 1534-1539 (2005).
  25. Dickson, E. J., Hille, B. Understanding phosphoinositides: rare, dynamic, and essential membrane phospholipids. Biochemical Journal. 476 (1), 1-23 (2019).
  26. Mellman, D. L., et al. A PtdIns4,5P2-regulated nuclear poly(A) polymerase controls expression of select mRNAs. Nature. 451 (7181), 1013-1017 (2008).
  27. Lee, Y. S., Mulugu, S., York, J. D., O’Shea, E. K. Regulation of a cyclin-CDK-CDK inhibitor complex by inositol pyrophosphates. Science. 316 (5821), 109-112 (2007).
  28. Nagy, A. I., et al. IP3 signalling regulates exogenous RNAi in Caenorhabditis elegans. EMBO Reports. 16 (3), 341-350 (2015).
  29. Hall, B. S., et al. TbVps34, the trypanosome orthologue of Vps34, is required for Golgi complex segregation. Journal of Biological Chemistry. 281 (37), 27600-27612 (2006).
  30. Rodgers, M. J., Albanesi, J. P., Phillips, M. A. Phosphatidylinositol 4-kinase III-beta is required for Golgi maintenance and cytokinesis in Trypanosoma brucei. Eukaryotic Cell. 6 (7), 1108-1118 (2007).
  31. Gilden, J. K., et al. The role of the PI(3,5)P2 kinase TbFab1 in endo/lysosomal trafficking in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 214, 52-61 (2017).
  32. Demmel, L., et al. The endocytic activity of the flagellar pocket in Trypanosoma brucei is regulated by an adjacent phosphatidylinositol phosphate kinase. Journal of Cell Science. 129 (11), 2285 (2016).
  33. Gimenez, A. M., et al. Phosphatidylinositol kinase activities in Trypanosoma cruzi epimastigotes. Molecular and Biochemical Parasitology. 203 (1-2), 14-24 (2015).
  34. Hashimoto, M., et al. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor regulates replication, differentiation, infectivity and virulence of the parasitic protist Trypanosoma cruzi. Molecular Microbiology. 87 (6), 1133-1150 (2013).
  35. Cestari, I., Haas, P., Moretti, N. S., Schenkman, S., Stuart, K. Chemogenetic Characterization of Inositol Phosphate Metabolic Pathway Reveals Druggable Enzymes for Targeting Kinetoplastid Parasites. Cell Chemical Biology. 23 (5), 608-617 (2016).
  36. Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores. Journal of Biological Chemistry. 277 (29), 25870-25876 (2002).
  37. McNamara, C. W., et al. Targeting Plasmodium PI(4)K to eliminate malaria. Nature. 504 (7479), 248-253 (2013).
  38. Tresaugues, L., et al. Structural basis for phosphoinositide substrate recognition, catalysis, and membrane interactions in human inositol polyphosphate 5-phosphatases. Structure. 22 (5), 744-755 (2014).
  39. Varnai, P., et al. Quantifying lipid changes in various membrane compartments using lipid binding protein domains. Cell Calcium. 64, 72-82 (2017).
  40. Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Letters. 590 (15), 2454-2468 (2016).
  41. Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains–their role in signalling and membrane trafficking. Current Biology. 11 (21), 882-893 (2001).
  42. Klarlund, J. K., et al. Signaling by phosphoinositide-3,4,5-trisphosphate through proteins containing pleckstrin and Sec7 homology domains. Science. 275 (5308), 1927-1930 (1997).
  43. Wild, R., et al. Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains. Science. 352 (6288), 986-990 (2016).
  44. Gerasimaite, R., et al. Inositol Pyrophosphate Specificity of the SPX-Dependent Polyphosphate Polymerase VTC. ACS Chemical Biology. 12 (3), 648-653 (2017).
  45. Potapenko, E., et al. 5-Diphosphoinositol pentakisphosphate (5-IP7) regulates phosphate release from acidocalcisomes and yeast vacuoles. Journal of Biological Chemistry. 293 (49), 19101-19112 (2018).
  46. Wu, M., Chong, L. S., Perlman, D. H., Resnick, A. C., Fiedler, D. Inositol polyphosphates intersect with signaling and metabolic networks via two distinct mechanisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6757-6765 (2016).
  47. Jungmichel, S., et al. Specificity and commonality of the phosphoinositide-binding proteome analyzed by quantitative mass spectrometry. Cell Reports. 6 (3), 578-591 (2014).
  48. Yang, X., Figueiredo, L. M., Espinal, A., Okubo, E., Li, B. RAP1 is essential for silencing telomeric variant surface glycoprotein genes in Trypanosoma brucei. Cell. 137 (1), 99-109 (2009).
  49. Cestari, I., Stuart, K. Transcriptional Regulation of Telomeric Expression Sites and Antigenic Variation in Trypanosomes. Current Genomics. 19 (2), 119-132 (2018).
  50. Clough, T., Thaminy, S., Ragg, S., Aebersold, R., Vitek, O. Statistical protein quantification and significance analysis in label-free LC-MS experiments with complex designs. BMC Bioinformatics. 13, 6 (2012).
  51. Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei. Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).
  52. DeGrasse, J. A., Chait, B. T., Field, M. C., Rout, M. P. High-yield isolation and subcellular proteomic characterization of nuclear and subnuclear structures from trypanosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 77-92 (2008).
  53. Opperdoes, F. R. A rapid method for the isolation of intact glycosomes from Trypanosoma brucei by Percoll -gradient centrifugation in a vertical rotor. Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (3), 181-186 (1981).
  54. Pereira, N. M., de Souza, W., Machado, R. D., de Castro, F. T. Isolation and properties of flagella of trypanosomatids. The Journal of protozoology. 24 (4), 511-514 (1977).
  55. Subota, I., et al. Proteomic analysis of intact flagella of procyclic Trypanosoma brucei cells identifies novel flagellar proteins with unique sub-localization and dynamics. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (7), 1769-1786 (2014).
  56. Fukuda, M., Kojima, T., Kabayama, H., Mikoshiba, K. Mutation of the pleckstrin homology domain of Bruton’s tyrosine kinase in immunodeficiency impaired inositol 1,3,4,5-tetrakisphosphate binding capacity. Journal of Biological Chemistry. 271 (48), 30303-30306 (1996).
  57. Knodler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. BioTechniques. 38 (6), (2005).
  58. Best, M. D. Global approaches for the elucidation of phosphoinositide-binding proteins. Chemistry and Physics of Lipids. 182, 19-28 (2014).

Tags

Inositol PhosphatePhosphoinositideProtein BindingAffinity ChromatographyWestern BlotMass SpectrometryRegulatory FunctionSignal TransductionCell DevelopmentBiotinylatedLyposome FreeT. BruceiPBS-GLysis BufferProtease InhibitorPhosphatase InhibitorBinding Assay
check_url/kr/59865?article_type=t&slug=identification-inositol-phosphate-or-phosphoinositide-interacting

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Cestari, I. Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (149), e59865, doi:10.3791/59865 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image