Detta protokoll fokuserar på identifiering av proteiner som binder till inositol fosfater eller phosphoinositides. Den använder affinitetskromatografi med biotinylerade inositol fosfater eller phosphoinositides som immobiliseras via konjugerat till aguppstod eller magnetiska pärlor. Inositol fosfat eller fosfoinositid bindande proteiner identifieras genom Western blotting eller masspektrometri.
Inositol fosfater och phosphoinositides reglera flera cellulära processer i eukaryotes, inklusive genuttryck, vesikel trafficking, signaltransduktion, metabolism, och utveckling. Dessa metaboliter utföra denna reglerande aktivitet genom bindning till proteiner, därmed förändrade protein konformation, katalytisk aktivitet, och/eller interaktioner. Den metod som beskrivs här använder affinitetskromatografi kopplad till masspektrometri eller Western blotting att identifiera proteiner som interagerar med inositol fosfater eller phosphoinositides. Inositol fosfater eller phosphoinositides är kemiskt märkta med biotin, som sedan fångas via konjugerat konjugerat till aguppstod eller magnetiska pärlor. Proteiner isoleras genom sin affinitet av bindning till metaboliten, sedan eluerade och identifieras genom masspektrometri eller Western blotting. Metoden har ett enkelt arbetsflöde som är känsligt, icke-radioaktivt, Liposome-fritt, och anpassningsbara, stödja analys av protein och metabolit interaktion med precision. Denna metod kan användas i etikettfri eller i aminosyremärkta kvantitativa masspektrometrimetoder för att identifiera interaktioner med proteinmetabolit i komplexa biologiska prover eller med hjälp av renade proteiner. Detta protokoll är optimerat för analys av proteiner från Trypanosoma rhodesiense, men det kan anpassas till relaterade protozoer parasiter, jäst eller däggdjursceller.
Inositol fosfater (IPS) och phosphoinositides (Pis) spelar en central roll i eukaryotebiologi genom regleringen av cellulära processer såsom kontroll av genuttryck1,2,3, vesikel trafficking 4, signaltransduktion5,6, metabolism7,8,9, och utveckling8,10. Reglerande funktion av dessa metaboliter resulterar från deras förmåga att interagera med proteiner och därmed reglera proteinfunktion. Vid bindning av proteiner, IPs och PIs kan förändra protein konformation11, katalytisk aktivitet12, eller interaktioner13 och därmed påverka cellulär funktion. IPS och Pis distribueras i flera subcellulära fack, såsom Nucleus2,3,14,15, endoplasmatiska Retikulum16,17, plasma membran1 och Cytosol18, antingen associerat med proteiner3,19 eller med rnas20.
Klyvning av membran-associerade PI (4,5) P2 av fosfolipas C resulterar i frisättning av ins (1, 4, 5) P3, som kan fosforyleras eller defosforyleras genom IP-kinaser respektive fosfataser. IPs är lösliga molekyler som kan binda till proteiner och utöva reglerande funktioner. Till exempel, ins (1, 4, 5) P3 i metazoan kan fungera som en andra budbärare genom bindning till IP3-receptorer, som inducerar receptor överensstämmelser förändringar och därmed frisättning av ca2 + från intracellulära butiker11. Ins (1, 3, 4, 5) P4 binder till histondeacetylase-komplexet och reglerar proteinkomplex montering och aktivitet13. Andra exempel på IPS reglerande funktion omfattar kontroll av kromatin organisation21, RNA transport22,23, RNA redigering24, och transkription1,2,3 . Däremot är PIs ofta förknippade med rekrytering av proteiner till plasmamembranet eller organell membran25. En framväxande egenskap hos Pis är dock förmågan att associera med proteiner i en icke-membranös miljö3,15,19,26. Detta är fallet med den nukleära receptorn steroidogena Factor, som transkriptionella kontrollfunktion regleras av PI (3, 4, 5) P319, och Poly-A polymeras som enzymatisk aktivitet regleras av kärn-PI (4,5) P226. En reglerande roll för IPS och Pis har visats i många organismer, inklusive jäst22,27, däggdjursceller19,23, Drosophila10 och Worms28. Av betydelse är den roll som dessa metaboliter i trypanosomes, som divergerat tidigt från eukaryotiska härstamning. Dessa metaboliter spelar en viktig roll i Trypanosoma rhodesiense transkriptionella kontroll1,3, utveckling8, organell biogenes och protein trafik29,30 , 31 , 32, och är också involverade i att kontrollera utveckling och infektion i patogenerna T. cruzi33,34,35, Toxoplasma36 och Plasmodium ,5 , 37. att förstå betydelsen av IPS och Pis i innebörder kan därför bidra till att belysa ny biologisk funktion för dessa molekyler och identifiera nya läkemedelsmål.
Specificiteten hos protein och IP eller PI bindning beror på protein samverkande domäner och fosforylering tillstånd av inositol13,38, även interaktioner med lipiddelen av Pis förekommer också19. Mångfalden av IPs och PIs och deras modifiera kinaser och fosfataser ger en flexibel cellulär mekanism för att kontrollera proteinfunktion som påverkas av metabolit tillgänglighet och överflöd, den fosforylering tillstånd av inositol, och protein interaktion1,3,13,38. Även om vissa protein domäner är väl kännetecknas39,40,41, t. ex., pleckstrin homologi domän42 och SPX (SYG1/Pho81/XPR1) domäner43 ,44,45, vissa proteiner interagerar med IPS eller Pis genom mekanismer som förblir okända. Till exempel, den repressor-Activator protein 1 (RAP1) av T. rhodesiense saknar kanoniska PI-bindande domäner men interagerar med PI (3, 4, 5) P3 och kontrollera transkription av gener inblandade i antigen variation3. Affinitetskromatografi och masspektrometri analys av IP-eller PI-interagerande proteiner från trypanosome, jäst eller däggdjursceller identifierade flera proteiner utan kända IP-eller PI-bindande domäner8,46, 47. data tyder på ytterligare okarakteriserade protein domäner som binder till dessa metaboliter. Därför kan identifieringen av proteiner som interagerar med IPs eller PIs avslöja nya mekanismer för interaktion med proteinmetabolit och nya cellulära reglerande funktioner för dessa små molekyler.
Den metod som beskrivs här använder affinitetskromatografi kopplad till västerländsk blotting eller masspektrometri för att identifiera proteiner som binder till IPs eller PIs. Den använder biotinylerade IPS eller Pis som är antingen tvärbunden till konjugerat konjugerat till agarpärlor eller alternativt, fångas via konjugerat-konjugerade magnetiska pärlor (figur 1). Metoden ger ett enkelt arbetsflöde som är känsligt, icke-radioaktivt, Liposome-fritt och lämpar sig för att detektera bindningen av proteiner från cell celllysat eller renade proteiner3 (figur 2). Metoden kan användas i etikettfria8,46 eller kopplad till aminosyramärkt kvantitativ masspektrometri47 för att identifiera IP-eller PI-bindande proteiner från komplexa biologiska prover. Därför är denna metod ett alternativ till de få metoder som finns för att studera samspelet mellan IPS eller Pis med cellulära proteiner och kommer att bidra till att förstå reglerande funktion av dessa metaboliter i innebörder och kanske andra eukaryotes.
Identifieringen av proteiner som binder till IPs eller PIs är avgörande för att förstå den cellulära funktionen av dessa metaboliter. Affinitetskromatografi kopplad till Western blot eller masspektrometri erbjuder en möjlighet att identifiera IP-eller PI-samverkande proteiner och därmed få insikter om deras reglerande funktion. IPS eller Pis kemiskt märkta [t. ex., ins (1, 4, 5) P3 kemiskt kopplad till biotin] och tvärbunden till Agros pärlor via konjugerat eller fångas av konjugerat magnetiska pärlor till?…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av naturvetenskapliga och tekniska forskningsrådet i Kanada (NSERC, RGPIN-2019-04658); NSERC Discovery lansering tillägg för tidiga karriär forskare (DGECR-2019-00081) och av McGill University.
Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | Ketone |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | Solvent |
Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | A6141 | Inorganic salt |
Centrifuge Avanti J6-MI | Beckman Coulter | Avanti J6-MI | Centrifuge for large volumes (e.g., 1L) |
Centrifuge botles | Sigma-Aldrich | B1408 | Bottles for centrifugation of 1L of culture |
Control Beads | Echelon | P-B000-1ml | Affinity chromatography reagent – control |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Sugar, Added in PBS to keep cells viable |
Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 1610610 | Reducing agent |
Dynabeads M-270 Streptavidin | ThermoFisher Scientific | 65305 | Streptavidin beads for binding to biotin ligands |
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | Protease inhibitors |
Electrophoresis running buffer | Bio-Rad | 1610732 | 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3 |
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning Life Sciences | 430052 | To centrifuge 10 mL cultures |
Formic acid | Sigma-Aldrich | 106526 | Acid |
Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | Amino acid |
HMI-9 cell culture medium | ThermoFisher Scientific | ME110145P1 | Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms |
Imperial Protein Stain | ThermoFisher Scientific | 24615 | Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE |
Ins(1,4,5)P3 Beads | Echelon | Q-B0145-1ml | Affinity chromatography reagent |
Instant Nonfat Dry Milk | Thomas Scientific | C837M64 | Blocking reagent for Western blotting |
Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides |
Lab Rotator | Thomas Scientific | 1159Z92 | For binding assays |
LoBind Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 13-698-793 | Low protein binding tubes for mass spectrometry |
Nonidet P-40 (Igepal CA-630) | Sigma-Aldrich | 21-3277 | Detergent |
PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010031 | Physiological buffer |
Peroxidase substrate for chemiluminescence | ThermoFisher Scientific | 32106 | Substrate for Western bloting detection of proteins |
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4906845001 | Phosphatase inhibitors |
PI(3)P PIP Beads | Echelon | P-B003a-1ml | Affinity chromatography reagent |
PI(3,4)P2 PIP Beads | Echelon | P-B034a-1ml | Affinity chromatography reagent |
PI(3,4,5)P3 diC8 | Echelon | P-3908-1mg | Affinity chromatography reagent |
PI(3,4,5)P3 PIP Beads | Echelon | P-B345a-1ml | Affinity chromatography reagent |
PI(3,5)P2 PIP Beads | Echelon | P-B035a-1ml | Affinity chromatography reagent |
PI(4)P PIP Beads | Echelon | P-B004a-1ml | Affinity chromatography reagent |
PI(4,5)P2 diC8 | Echelon | P-4508-1mg | Affinity chromatography reagent |
PI(4,5)P2 PIP Beads | Echelon | P-B045a-1ml | Affinity chromatography reagent |
PI(5)P PIP Beads | Echelon | P-B005a-1ml | Affinity chromatography reagent |
Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid) |
Potassium hexacyanoferrate(III) | Sigma-Aldrich | 702587 | Potassium salt |
PtdIns PIP Beads | Echelon | P-B001-1ml | Affinity chromatography reagent |
PVDF Membrane | Bio-Rad | 1620177 | For Western blotting |
Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5910 R | Microcentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL) |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 862010 | Detergent |
Sodium thiosulfate | Sigma-Aldrich | 72049 | Chemical |
SpeedVac Vacuum Concentrators | ThermoFisher Scientific | SPD120-115 | Sample concentration (e.g., for mass spectrometry) |
T175 flasks for cell culture | ThermoFisher Scientific | 159910 | To grow 50 mL T. brucei culture |
Trypsin, Mass Spectrometry Grade | Promega | V5280 | Trypsin for protein digestion |
Urea | Sigma-Aldrich | U5128 | Denaturing reagent |
Vortex | Fisher Scientific | 02-215-418 | For mixing reactions |
Western blotting transfer buffer | Bio-Rad | 1610734 | 25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol |
Whatman 3 mm paper | Sigma-Aldrich | WHA3030861 | Paper for Wester transfer |
2-mercaptoethanol (14.2 M) | Bio-Rad | 1610710 | Reducing agent |
2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | Protein loading buffer |
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561094 | Gel for protein electrophoresis |
4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0747 | Protein loading buffer |