Reconstitution assistée par détergent de Recombinant Drosophila Atlastin en Liposomes pour des essais de mélange de lipides
Summary
La fusion des membranes biologiques est catalysée par des protéines de fusion spécialisées. La mesure des propriétés fusogéniques des protéines peut être obtenue par des essais de mélange de lipides. Nous présentons une méthode pour purifier l’atlastine recombinante de Drosophila, une protéine qui médiatise la fusion homotypique de l’ER, la reconstituant aux liposomes préformés, et testant la capacité de fusion.
Abstract
La fusion de membrane est un processus crucial dans la cellule eucaryotique. Des protéines spécialisées sont nécessaires pour catalyser la fusion. Les atlastines sont des protéines réticulum-endoplasmiques (ER) impliquées dans la fusion homotypique de l’ER. Nous détaillons ici une méthode pour purifier un glutathion S-transferase (GST) et poly-histidine marqué Drosophila atlastin par deux séries de chromatographie d’affinité. L’étude des réactions de fusion in vitro nécessite l’insertion de protéines de fusion purifiées dans une couche lipidique. Les liposomes sont des membranes modèles idéales, car la composition et la taille des lipides peuvent être ajustées. À cette fin, nous décrivons une méthode de reconstitution par l’enlèvement de détergent pour drosophila atlastin dans les liposomes préformés. Tandis que plusieurs méthodes de reconstitution sont disponibles, la reconstitution par l’enlèvement de détergent a plusieurs avantages qui le rendent approprié pour des atlastins et d’autres protéines semblables. L’avantage de cette méthode comprend un rendement de reconstitution élevé et une orientation correcte de la protéine reconstituée. Cette méthode peut être étendue à d’autres protéines membranaires et à d’autres applications qui nécessitent des protéoliposomes. En outre, nous décrivons un test de mélange de lipides basé sur FRET des protéoliposomes utilisés comme mesure de la fusion de membrane.
Introduction
La fusion de membrane est un processus critique dans beaucoup de réactions biologiques. Dans des conditions biologiques, la fusion de la membrane n’est pas spontanée et nécessite des protéines de fusion spécialisées pour catalyser ces réactions1. ER fusion de membrane homotypic est médiée chez les animaux par le dynamin liés GTPase atlastin2. Le rôle d’Atlastin dans la fusion homotypique est fondamental pour les jonctions à trois voies dans les urgences périphériques, qui constituent un grand réseau interconnecté de tubules qui s’étendent dans toute la cellule. Les atlastines ont une morphologie de domaine conservée composée d’un grand GTPase, d’un domaine intermédiaire de faisceau detrois hélices, d’une ancre hydrophobe de membrane, et d’une courte queue Cytoplasmique C-terminal 3. Des études in vitro avec recombinant Drosophila atlastin ont montré que lorsqu’il est reconstitué en liposomes, il maintient ses propriétés fusogéniques. D’autres atlastines, y compris les homologs humains n’ont pas été en mesure de récapituler la fusion in vitro. Nous décrivons ici une méthodologie pour purifier une TPS et poly-histidine étiquetée recombinante Drosophila atlastin, la reconstituer en liposomes, et d’essayer la fusion.
L’étude de la fusion de membrane in vitro présente un défi car les protéines fusogéniques ont habituellement une ancre de membrane. Pour les étudier, il est nécessaire de les reconstituer en bicouches lipidiques modèles. Les grandes vésicules unilamellaires (LUV) sont un outil utile pour étudier les interactions entre protéines lipidiques. Nous présentons ici un système pour faire des VUS de différentes compositions lipidiques pour la reconstitution des protéines et les analyses de fusion. La reconstitution des protéines intégrales en JV peut être réalisée par une variété de méthodes, y compris,la reconstitution organique de solvant-négocié, les mécanismes mécaniques, ou la reconstitution assistée de détergent 4. Nous présentons ici une méthode pour reconstituer d’atlastin de Drosophila en liposomes préformés par l’enlèvement de détergent. Les avantages de cette méthode de reconstitution incluent des rendements élevés de reconstitution et l’orientation appropriée de l’atlastine dans la bicouche de lipide. En outre, grâce à cette méthode, la protéine n’est pas séchée ou exposée à des solvants organiques, maintenant ainsi la structure et la fonction. Parmi ses inconvénients, la présence de détergents peut ne pas être idéal pour toutes les protéines et les protéoliposomes finaux peuvent avoir un certain détergent incorporé dans la bicouche lipidique. D’autres dialyses peuvent être utilisées pour éliminer davantage le détergent. Cependant, la dialyse peut prendre beaucoup de temps et peut donc entraîner une perte d’activité protéique.
L’évaluation de l’activité de fusion de l’atlastine peut être déterminée par des essais de mélange de lipides comme décrit précédemment2. Ici, nous délinons une méthode pour mesurer la fusion médiée par N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl (NBD)/Lissamine rhodamine-B sulfonyl (rhodamine) lipides étiquetés. Cet test nécessite la fusion de protéoliposomes donneurs (étiquetés) et de protéoliposomes accepteurs (non étiquetés). Une libération de FRET peut être mesurée au cours de la réaction comme la dilution d’une paire donneur-acceptant de liposomes « étiquetés » à des liposomes « non étiquetés » à la suite du mélange de lipides pendant la fusion de membrane (figure 1)5. Bien que cet assay serve de proxy pour la fusion de membrane, il est limité dans la distinction entre la fusion de membrane et l’hémifusion, un état où seuls les folioles extérieures se mélangent. Pour résoudre ce problème, une alternative est l’étanchéité externe de la DNB par la dithionite. Suivant la même méthodologie que NBD/rhodamine lipides mélangeant des essais, lors de l’étanchéité du dépliant externe toute libération NBD FRET par fusion sera due à la foliole interne mélange8.
Des essais alternatifs de fusion par le contenu aqueux intérieur mélangeant l’adresse pleine fusion seulement5. Des exemples de ceci sont le terbium (Tb)/acide dipicolinique (DPA) essais et l’acide trisulfonic aminonaphthalene (ANTS)/p-xylène bis (pyridinium) bromure (DPX) essais. Dans tb/DPA, un pool de liposomes avec tb encapsulé sont mélangés et fusionnés avec des liposomes avec dPA encapsulé; lors de la fusion, la fluorescence est augmentée par transfert d’énergie interne de DPA à Tb dans le [Tb(DPA)3]3- chelation complexe6. En revanche, pour les essais ANTS/DPX, la fluorescence ANTS est étanchée par DPX7. Bien que ces systèmes traitent du mélange de contenu interne, une préparation plus approfondie des liposomes est nécessaire pour l’élimination des réactifs non encapsulés, ainsi que l’interaction involontaire des fluorophores.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les méthodes ici délimiter une méthode efficace pour purifier, reconstituer, et mesurer l’activité de fusion de l’atlastine recombinante. Pour assurer des rendements élevés de l’atlastine fonctionnelle, certaines étapes critiques doivent être prises en considération. L’expression de l’atlastine doit être faite à basse température (16 oC) pour éviter l’agrégation et il faut viser une concentration finale entre 0,4 et 1,5 mg/mL. Les protéines très diluées ne seront pas reconstituées de manière optimale ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Michael Stern et son laboratoire pour leurs idées et leurs commentaires sur les projets liés à l’atlastine. Ces travaux ont été soutenus par l’Institut national des sciences médicales générales [R01GM101377] et l’Institut national des troubles neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux [R01NS102676].
Materials
| 10 mL poly-prep chromatography columns | Biored | 731-1550 | |
| 10 x 75 mm Flint glass tubes | VWR | 608225-402 | |
| 47 mm diameter, 0.45um pore whatman sterile membrane filters | Whatman | 7141 104 | |
| 96 well white plate | NUNC | 437796 | |
| Anapoe X-100 | Anatrace | 9002-931-1 | |
| Cell disrupter | Avestin | Avestin Emulsiflex C3 | |
| DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)) | Avanti | 840035P-10mg | DOPS |
| EDTA | Research organics inc. | 6381-92-6 | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Complete protease inhibitor |
| Extruder | Sigma Aldrich | Z373400 | Liposofast Basic Extruder |
| GE Akta Prime liquid chromatography system | GE Pharmacia | 8149-30-0006 | |
| Glutathione agarose beads | Sigma aldrich | G4510-50ml | |
| Glycerol | EMD | GX0185-5 | |
| GTP | Sigma Aldrich | 36051-31-7 | Guanosine 5' triphosphate sodium salt hydrate |
| HEPES, acid free | Omnipur | 5330 | |
| Imidazole | fluka | 5670 | |
| Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column | GE Healthcare | 17040801 | 1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns |
| Iohexol | Accurate chemical and scientific corporation | AN 7050 BLK | Accudenz/Nycodenz |
| IPTG | Research products international corp. | I56000-100.0 | IPTG, dioxane free |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5g | |
| Magnesium chloride | Fisher | 7791-18-6 | |
| Methanol | Omnisolv | MX0488-1 | |
| NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | NBD-DPPE |
| n-Dodecyl β-D-maltoside | Chem-Impex International | 21950 | |
| Nonpolar polystyrene adsorbent beads | BioRad | 152-3920 | SM2 Biobeads |
| Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 um pore membrane | Whatman | 800309 | |
| Optima LE80K Ultra centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Phosphatidylcholine, L-α-dipalmitoyl [choline methyl-3H] | ARC | ART0284 | Titriated lipids |
| Plate reader | TECAN | TECAN infinite M200 plate reader | |
| POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) | Avanti | 850457C-25mg | POPC |
| Potassium chloride | MP | 151944 | |
| Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | Rh-DPPE |
| Scintillation Cocktail | National Diagnostics | LS-272 | Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples |
| Scintillation vials | Beckman | 592928 | Fast turn cap Mini Poly-Q Vial |
| Thrombin | Sigma | T1063-1kU | Thrombin from human plasma |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Ultra-clear centrifuge tubes 5 x 41 mm | Beckman | 344090 | |
| Vortex 9 to 13mm Tube Holder | VWR | 58816-138 | Insert for vortexing flint glass tubes |
| Vortex Insert Retainer | VWR | 58816-132 | Retainer needed for vortex tube holder |
| Vortexer | VWR | 2.235074 | Vortex Genie 2 model G560 |
| β-mercaptoethanol molecular biology grade | Calbiochem | 444203 |
References
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