생물학적 막 융합은 특수 융합 단백질에 의해 촉매됩니다. 단백질의 fusogenic 특성을 측정하는 것은 지질 혼합 분석을 통해 달성될 수 있다. 우리는 재조합 Drosophila 아틀라를 정화하는 방법을 제시, ER의 상모 융합을 중재하는 단백질, 미리 형성 된 리포솜에 그것을 재구성, 융합 용량에 대한 테스트.
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이 논문에서
요약
초록
막 융합은 진핵 세포에서 중요한 과정입니다. 융합을 촉매하려면 특수 단백질이 필요합니다. 아틀라스틴은 ER의 상동성 융합에 연루된 소포체(ER) 상주 단백질이다. 여기서 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)와 폴리히스티딘 태그가 붙은 드로소필라 아플라스틴을 친화성 크로마토그래피의 두 라운드로 정화하는 방법을 자세히 설명합니다. 시험관 내에서 융합 반응을 연구하려면 정제된 융합 단백질을 지질 이중층으로 삽입해야 합니다. 리포솜은 지질 조성 및 크기가 조정될 수 있기 때문에 이상적인 모델 막이다. 이를 위해, 우리는 미리 형성 된 리포좀으로 초파리 아플라스틴에 대한 세제 제거에 의해 재구성 방법을 설명합니다. 여러 가지 재구성 방법을 사용할 수 있지만, 세제 제거에 의한 재구성은 아틀라스틴 및 기타 유사한 단백질에 적합한 몇 가지 장점이 있습니다. 이 방법의 장점은 재구성 된 단백질의 높은 재구성 수율 및 올바른 배향을 포함한다. 이 방법은 단백질을 필요로 하는 그밖 막 단백질 및 그밖 용도로 확장될 수 있습니다. 추가적으로, 우리는 막 융합의 측정으로 이용된 프로테올리포좀의 FRET 기반 지질 혼합 분석사를 기술한다.
서론
막 융합은 많은 생물학적 반응에서 중요한 과정입니다. 생물학적 조건하에서, 막 융합은 자발적이지 않으며 그러한 반응을 촉매하기위해 전문화된 융합 단백질이 필요합니다 1. ER 상형 막 융합은 다이너닌 관련 GTPase 아플라스틴2에의해 동물에서 매개된다. 상모융합에서 아틀라스틴의 역할은 세포 전체에 걸쳐 확장되는 튜블의 큰 상호 연결된 네트워크를 구성하는 주변 ER의 3방향 접합에 대한 기본입니다. 아틀라스틴은 대형 GTPase, 3개의 나선 번들 중간 도메인, 소수성 멤브레인 앵커 및 짧은 세포질 C-말단 꼬리3으로구성된 보존된 도메인 형태를 가진다. 재조합 드로 소 필아슬아슬라 아플라스틴과 생체 외 연구는 리포솜으로 재구성 할 때, 그것은 그것의 fusogenic 속성을 유지하는 것으로 나타났습니다. 인간 상동체를 포함한 다른 아슬아슬증은 시험관 내에서 융합을 재현할 수 없었다. 우리는 여기에 GST와 폴리 히스티딘 태그 재조합 초파리 아틀라스틴을 정화하기위한 방법론을 설명, 리포솜에 그것을 재구성, 및 융합을 해석.
시험관내에서 막 융합을 연구하는 것은 일반적으로 막 앵커를 가지고 있는 푸소제닉 단백질로서 도전....
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프로토콜
1. GST-DAtl-His8의 정화
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단백질 발현 및 포해준비
- pGEX4-T3 2의 GST-DAtl-His8 구성으로 BL21(DE3) 대장균을 변환하고 암피실린 플레이트에서 선택합니다.
- 14 mL 배양 튜브에서 단일 형질전환 및 접종 5 mL LB + ampicillin (5 μL 의 100 mg/mL ampicillin)을 선택하고 25 °C에서 배양하여 6-8 시간 동안 200 rpm에서 흔들어.
참고: 누수 발현으로 인해 더 높은 온도에서 배양하지 않는 것이 좋습니다. 25°C에서의 성장은 이 성장 기간 동안 단백질의 응집을 감소시킨다. - 5 mL 배양물의 1 mL로 LB + 암피실린의 200 mL을 접종하고 25 °C에서 밤새 배양 (~15-18 시간).
- 다음날 아침, 원심분리(10분 동안 2,000 x g)로 세포를 수확하고 5 mL의 LB에서 다시 중단합니다.
- LB + 암피실린 4 L을 접종하고 OD600 (0.05-0.15)을 측정하십시오. 25 °C에서 흔들어 서 배양.
참고: 박테리아를 추....
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결과
아슬라스틴 재구성의 효율성은 그림2에 제시되어 있습니다. 재구성된 프로테오폴리포솜은 요오헥솔 불연속 그라데이션에 떠 있었다. 통합되지 않은 단백질을 하부층(B) 또는 중간층(M)에서 침전시켰다. 재구성된 단백질은 최상위 층(T)에 떠있을 것이다. 그라데이션의 샘플을 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색에 의해 수확 및 분석하였다. 밀도측정에 의한 겔의 정량화는 무시할 수 있는 손실로 재구성의 매우 높은 효율을 나타낸다; 총 단백질의 96%가 상부층(T)에 떠 있는 프로테올리포좀으로 발견되었다. 단백질의 1% 미만이 재구성되지 않고 중간 층(M)에서 발견되었고, 단지 3%만이 분해되지 않거나 응집되어 하부 층(B)에 침전되었다.
재구성의 정도를 설명하는 것 외에도, 재구성 후 아틀라스틴의 배향을 분석하는 것은 트롬빈 분열 분석제14에의해 정량화되었다. 재구성된 단백질은 잠재적으로 리포좀의 내.......
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토론
여기서 방법은 재조합 아슬란스틴의 융합 활성을 정화, 재구성 및 측정하기위한 효율적인 방법을 묘사합니다. 기능 적 아플라스틴의 높은 수율을 보장하기 위해 몇 가지 중요한 단계를 고려해야합니다. 아슬란스틴의 발현은 응집을 피하기 위해 저온 (16 °C)에서 수행해야하며 0.4-1.5 mg / mL 사이의 최종 농도를 목표로해야합니다. 매우 희석된 단백질은 지질 비율로 1:400 단백질로 최적으로 재구성되지 않을 것이다. 재구성 효율은 여기서 설명한 부동 분석에의해 선택적으로 분석될 수 있다(도 2). 리포좀 부유 분석의 장점 중 하나는 지질 이중층13과연관된 수용성 단백질을 분석하기 위해 확장될 수 있다는 것이다. 추가적으로, 재구성된 단백질의 배향은 또한 프로테아제소화(14)에 의해 분석될 수 있지만, 이것은 잘못된 방향으로 재구성된 잘못 접히거나 응집된 단백질 또는 재구성을 구별하지 않을 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
마이클 스턴 박사와 그의 연구실에서 아플라스틴 관련 프로젝트에 대한 통찰력과 피드백에 감사드립니다. 이 작품은 일반 의학의 국립 연구소에 의해 지원되었다 [R01GM101377] 신경 장애 및 뇌졸중의 국립 연구소 [R01NS102676].
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 10 mL 폴리-프렙 크로마토그래피 컬럼 | Biored | 731-1550 | |
| 10 mm x 75 mm 플린트 유리관 | VWR | 608225-402 | |
| 47 mm 직경, 0.45 μ m pore Whatman 멸균 멤브레인 필터 | Whatman | 7141 104 | |
| 96 웰 화이트 플레이트 | NUNC | 437796 | |
| Anapoe X-100 | Anatrace | 9002-931-1 | |
| 세포 교란 자 | Avestin | Avestin Emulsiflex C3 | |
| DOPS (1,2- 디올레올 일 -sn- 글리세로 -3- 포스 포 -L- 세린 (나트륨 염)) | Avanti | 840035P-10mg | DOPS |
| EDTA | 리서치 오가닉스 Inc. | 6381-92-6 | 에틸렌디아민테트라아세트산 |
| EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일 | Roche | 11873580001 | 완전한 프로테아제 억제제 |
| 압출기 | Sigma Aldrich | Z373400 | Liposofast 기본 압출기 |
| GE Akta Prime 액체 크로마토 그래피 시스템 | GE Pharmacia | 8149-30-0006 | |
| 글루타티온 아가 로스 비즈 | 시그마 알드리치 | G4510-50ml | |
| 글리세롤 | EMD | GX0185-5 | |
| GTP | 시그마 알드리치 | 36051-31-7 | 구아 노신 5 '삼 인산 나트륨 염 수화물 |
| HEPES, 산성 무료 | Omnipur | 5330 | |
| Imidazole | fluka | 5670 | |
| Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) 수지 컬럼 | GE Healthcare | 17040801 | 1 mL HiTrap Chelating HP Immobilized metal affinity chromatography columns |
| Iohexol | Accurate chemical and scientific corporation | AN 7050 BLK | Accudenz/Nycodenz |
| IPTG | Research products international corp. | I56000-100.0 | IPTG, 다이옥산 프리 |
| L-글루타티온 감소 | 시그마-알드리치 | G4251-5g | |
| 염화마그네슘 | Fisher | 7791-18-6 | |
| 메탄올 | 옴니솔브 | MX0488-1 | |
| NBD-DPPE(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(7-니트로-2-1,3-벤즈옥사디아졸-4-일)(암모늄염))아 | 반티 | 236495 | NBD-DPPE |
| n-Dodecyl β-D-maltoside | Chem-Impex International | 21950 | |
| 비극성 폴리스티렌 흡착 비드 | BioRad | 152-3920 | SM2 Biobeads |
| Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 μ m 기공 멤브레인 | Whatman | 800309 | |
| Optima LE80K 울트라 원심분리기 | Beckman Coulter | ||
| 포스파티딜콜린, L-&알파;-디팔미토일[콜린 메틸-3H] | ARC | ART0284 | 적정 지질 |
| 플레이트 리더 | TECAN | TECAN 무한 M200 플레이트 리더 | |
| POPC(1-팔미토일-2-올레오일-글리세로-3-포스포콜린) | Avanti | 850457C-25mg | POPC |
| 염화칼 | MP | 151944 | |
| Rh-DPPE(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(리사민 로다민 B 설포닐)(암모늄염))) | Avanti | 236495 Rh-DPPE | |
| 신틸레이션 칵테일 | National Diagnostics | LS-272 | Ecoscint XR 수성 또는 비수성 시료용 신틸레이션 솔루션 |
| 신틸레이션 바이알 | Beckman | 592928 | 패스트 턴 캡 Mini Poly-Q 바이알 |
| 트롬빈 | Sigma | T1063-1kU | 인간 플라즈마의 트롬빈 |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| 초투명 원심분리기 튜브 5 mm x 41 mm | Beckman | 344090 | |
| Vortex 9 to 13 mm 튜브 홀더 | VWR | 58816-138 | 볼텍싱 플린트 유리관 |
| 용 인서트Vortex Insert Retainer | VWR | 58816-132 | Vortex 튜브 홀더에 필요한 리테이너 |
| Vortexer | VWR | 2.235074 | Vortex Genie 2 모델 G560 |
| β-mercaptoethanol 분자 생물학 등급 | Calbiochem | 444203 |
참고문헌
- Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M. Mechanics of membrane fusion. Nature Structural and Molecular Biology. 15, 675-683 (2008).
- Orso, G., et al. Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin. Nature. 460, 978-983 (2009).
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재인쇄 및 허가
