लिपिड-मिश्रण परख के लिए Liposomes में रिकॉमबिनेंट Drosophila Atlastin के डिटर्जेंट की मदद से पुनर्गठन
Summary
जैविक झिल्ली संलयन विशेष संलयन प्रोटीन द्वारा उत्प्रेरित है। प्रोटीन के fusogenic गुणों को मापने लिपिड मिश्रण परख द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. हम पुनः संयोजक Drosophila atlastin, एक प्रोटीन है कि ईआर के homotypic संलयन मध्यस्थता, यह preformed liposomes के लिए पुनर्गठन, और संलयन क्षमता के लिए परीक्षण के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं.
Abstract
झिल्ली संलयन यूकैरियोटिक कोशिका में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है। संलयन को उत्प्रेरित करने के लिए विशेष प्रोटीन आवश्यक हैं। ए्टलैस्टिन एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) निवासी प्रोटीन हैं जो ईआर के होमोटाइपिक संलयन में फंसाया जाता है। हम यहाँ एक glutathione एस-ट्रांसफरेस (जीएसटी) और पॉली-हिस्टिडाइन को शुद्ध करने के लिए एक विधि का विस्तार करते हैं, जिसमें एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी के दो दौर द्वारा ड्रोसोफिला एटलास्टिन टैग किया गया है। इन विट्रो में संलयन प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए शुद्ध संलयन प्रोटीन को लिपिड द्विपरत में डाला जाना आवश्यक है। Liposomes आदर्श मॉडल झिल्ली हैं, के रूप में लिपिड संरचना और आकार समायोजित किया जा सकता है. यह अंत करने के लिए, हम drosophila atlastin के लिए preformed liposomes में डिटर्जेंट हटाने के द्वारा एक पुनर्गठन विधि का वर्णन. जबकि कई पुनर्गठन के तरीके उपलब्ध हैं, डिटर्जेंट हटाने के द्वारा पुनर्गठन कई फायदे हैं जो इसे atlastins और अन्य समान प्रोटीन के लिए उपयुक्त बनाते हैं। इस विधि का लाभ एक उच्च पुनर्गठन उपज और पुनर्गठन प्रोटीन का सही अभिविन्यास भी शामिल है. इस विधि अन्य झिल्ली प्रोटीन के लिए और अन्य अनुप्रयोगों है कि proteoliposomes की आवश्यकता के लिए बढ़ाया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, हम झिल्ली संलयन के माप के रूप में इस्तेमाल किया प्रोटीओलिपोसोम के एक FRET आधारित लिपिड मिश्रण परख का वर्णन.
Introduction
झिल्ली संलयन कई जैविक प्रतिक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है। जैविक परिस्थितियों में, झिल्ली संलयन सहज नहीं है और इस तरह की प्रतिक्रियाओं को उत्प्रेरित करने के लिए विशेष संलयन प्रोटीन की आवश्यकताहोती है 1। ईआर होमोटाइपिक झिल्ली संलयन डाइनामिन संबंधित जी.टी.पी.एस. एटलास्टिन2द्वारा जानवरों में मध्यस्थता की जाती है। समरूपीय संलयन में Atlastin की भूमिका परिधीय ईआर में तीन तरह के जंक्शनों के लिए मौलिक है, जो ट्यूबल के एक बड़े परस्पर नेटवर्क का गठन करता है जो पूरे सेल में विस्तार करता है। Atlastins एक संरक्षित डोमेन आकृति विज्ञान एक बड़े GTPase, एक तीन कुंडलिनी बंडल मध्य डोमेन, एक हाइड्रोफोबिक झिल्ली लंगर, और एक छोटी साइटोप्लाज्मिक सी-टर्मिनल पूंछ3से मिलकर है। रिकॉमबिनेंट Drosophila atlastin के साथ इन विट्रो अध्ययन में पता चला है कि जब liposomes के लिए पुनर्गठन, यह अपने fusogenic गुणों का कहना है. मानव समलॉग सहित अन्य atlastins इन विट्रो में संलयन recapitulate करने में सक्षम नहीं किया गया है. हम यहाँ एक जीएसटी और पॉली-हिस्टिडाइन टैग रिकॉमबिनेंट Drosophila atlastin के लिए एक पद्धति का वर्णन, यह liposomes के लिए पुनर्गठन, और फ्यूजन पराजय.
इन विट्रो में झिल्ली संलयन का अध्ययन एक चुनौती प्रस्तुत करता है क्योंकि फ्यूजोजेनिक प्रोटीन में आमतौर पर एक झिल्ली लंगर होता है। उन्हें अध्ययन करने के लिए, उन्हें मॉडल लिपिड बाइलेयर में पुनर्गठन करना आवश्यक है। बड़े unilamellar vesicles (LUV) लिपिड प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण हैं। हम यहाँ प्रोटीन पुनर्गठन और संलयन परख के लिए विभिन्न लिपिड रचनाओं के LUVs बनाने के लिए एक प्रणाली मौजूद है. LUVs में अभिन्न प्रोटीन का पुनर्गठन सहित तरीकों की एक किस्म द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, कार्बनिक विलायक मध्यस्थता पुनर्गठन, यांत्रिक तंत्र, या डिटर्जेंट सहायता प्रदान पुनर्गठन4. हम यहाँ डिटर्जेंट हटाने से preformed liposomes में Drosophila atlastin के पुनर्गठन के लिए एक विधि मौजूद है. इस पुनर्गठन विधि के लाभ उच्च पुनर्गठन पैदावार और लिपिड bilayer में atlastin के उचित अभिविन्यास शामिल हैं. इसके अतिरिक्त, इस विधि के माध्यम से, प्रोटीन सूखे या कार्बनिक सॉल्वैंट्स के संपर्क में नहीं है जिससे संरचना और समारोह को बनाए रखने. इसके नुकसान के अलावा, डिटर्जेंट की उपस्थिति सभी प्रोटीन के लिए आदर्श नहीं हो सकता है और अंतिम proteoliposomes लिपिड bilayer में कुछ शामिल डिटर्जेंट हो सकता है. इसके अलावा डायलिसिस डिटर्जेंट के अधिक को खत्म करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, डायलिसिस एक लंबा समय लग सकता है और इसलिए प्रोटीन गतिविधि की हानि हो सकती है।
Atlastin के संलयन गतिविधि का आकलन लिपिड मिश्रण assays द्वारा निर्धारित किया जा सकता है के रूप में पहले वर्णित2. यहाँ, हम N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl (NBD)/Lisamine rhodamine-B sulfonyl (rhodamine) लेबल लिपिड के माध्यम से atlastin मध्यस्थता संलयन को मापने के लिए एक विधि वर्णन. इस परख दाता के संलयन की आवश्यकता है (लेबल) proteoliposomes और स्वीकारकर्ता (unlabeled) proteoliposomes. एक FRET रिलीज एक दाता-स्वीकारक जोड़ी के कमजोर पड़ने के रूप में मापा जा सकता है “लेबल” liposomes करने के लिए “unlabeled” liposomes झिल्ली संलयन के दौरान लिपिड मिश्रण का एक परिणाम के रूप में (चित्र 1)5. हालांकि इस परख झिल्ली संलयन के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में कार्य करता है, यह झिल्ली संलयन और अर्धभ्रम, एक राज्य है जहां केवल बाहरी पत्रक मिश्रण के बीच भेद में सीमित है. इस मुद्दे को हल करने के लिए, एक विकल्प dithionite द्वारा NBD के बाहरी पत्रक शमन है. NBD/rhodamine लिपिड मिश्रण परख के रूप में एक ही पद्धति का पालन, बाहरी पत्रक किसी भी NBD FRET संलयन द्वारा जारी बुझाने पर आंतरिक पत्रक मिश्रण8के कारण होगा.
आंतरिक जलीय सामग्री मिश्रण पते पूर्ण संलयन केवल5द्वारा वैकल्पिक संलयन assays . इसके उदाहरण हैं- टेरबियम (टीबी)/डिपिकॉलिनिक एसिड (डीपीए) परख और अमीनाफ्थैलीन ट्राइसल्फोनिक एसिड (एएनटीएस)/पी-xylene bis (pyridinium) ब्रोमाइड (DPX) परख। Tb/DPA assays में, encapsulated Tb के साथ liposomes का एक पूल मिश्रित कर रहे हैं और encapsulated DPA के साथ liposomes के साथ जुड़े; संलयन पर, [Tb (DPA)3]3- chelation जटिल6के भीतर डीपीए से टीबी करने के लिए आंतरिक ऊर्जा हस्तांतरण के माध्यम से फ्लोरोसेंट बढ़ जाता है। इसके विपरीत, ANTS/DPX assays के लिए, ANTS फ्लोरोसेंट DPX7द्वारा बुझा दिया जाता है. जबकि इन प्रणालियों आंतरिक सामग्री मिश्रण पता है, liposomes की अधिक गहराई से तैयारी गैर-लम्बोद अभिकर्मकों को हटाने के लिए आवश्यक है, साथ ही fluorores के अनपेक्षित बातचीत.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ तरीकों शुद्ध करने के लिए एक कुशल विधि वर्णन, पुनर्गठन, और रिकॉमबिनेंट atlastin के संलयन गतिविधि को मापने. कार्यात्मक atlastin की उच्च पैदावार सुनिश्चित करने के लिए कुछ महत्वपूर्ण कदम पर विचार किया जाना चाहि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम अपनी अंतर्दृष्टि और atlastin संबंधित परियोजनाओं पर प्रतिक्रिया के लिए डॉ माइकल स्टर्न और उनकी प्रयोगशाला धन्यवाद. यह काम राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान [R01GM101377] और राष्ट्रीय न्यूरोलॉजिकल विकार और स्ट्रोक संस्थान [R01NS102676] द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 10 mL poly-prep chromatography columns | Biored | 731-1550 | |
| 10 x 75 mm Flint glass tubes | VWR | 608225-402 | |
| 47 mm diameter, 0.45um pore whatman sterile membrane filters | Whatman | 7141 104 | |
| 96 well white plate | NUNC | 437796 | |
| Anapoe X-100 | Anatrace | 9002-931-1 | |
| Cell disrupter | Avestin | Avestin Emulsiflex C3 | |
| DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)) | Avanti | 840035P-10mg | DOPS |
| EDTA | Research organics inc. | 6381-92-6 | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Complete protease inhibitor |
| Extruder | Sigma Aldrich | Z373400 | Liposofast Basic Extruder |
| GE Akta Prime liquid chromatography system | GE Pharmacia | 8149-30-0006 | |
| Glutathione agarose beads | Sigma aldrich | G4510-50ml | |
| Glycerol | EMD | GX0185-5 | |
| GTP | Sigma Aldrich | 36051-31-7 | Guanosine 5' triphosphate sodium salt hydrate |
| HEPES, acid free | Omnipur | 5330 | |
| Imidazole | fluka | 5670 | |
| Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column | GE Healthcare | 17040801 | 1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns |
| Iohexol | Accurate chemical and scientific corporation | AN 7050 BLK | Accudenz/Nycodenz |
| IPTG | Research products international corp. | I56000-100.0 | IPTG, dioxane free |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5g | |
| Magnesium chloride | Fisher | 7791-18-6 | |
| Methanol | Omnisolv | MX0488-1 | |
| NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | NBD-DPPE |
| n-Dodecyl β-D-maltoside | Chem-Impex International | 21950 | |
| Nonpolar polystyrene adsorbent beads | BioRad | 152-3920 | SM2 Biobeads |
| Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 um pore membrane | Whatman | 800309 | |
| Optima LE80K Ultra centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Phosphatidylcholine, L-α-dipalmitoyl [choline methyl-3H] | ARC | ART0284 | Titriated lipids |
| Plate reader | TECAN | TECAN infinite M200 plate reader | |
| POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) | Avanti | 850457C-25mg | POPC |
| Potassium chloride | MP | 151944 | |
| Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | Rh-DPPE |
| Scintillation Cocktail | National Diagnostics | LS-272 | Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples |
| Scintillation vials | Beckman | 592928 | Fast turn cap Mini Poly-Q Vial |
| Thrombin | Sigma | T1063-1kU | Thrombin from human plasma |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Ultra-clear centrifuge tubes 5 x 41 mm | Beckman | 344090 | |
| Vortex 9 to 13mm Tube Holder | VWR | 58816-138 | Insert for vortexing flint glass tubes |
| Vortex Insert Retainer | VWR | 58816-132 | Retainer needed for vortex tube holder |
| Vortexer | VWR | 2.235074 | Vortex Genie 2 model G560 |
| β-mercaptoethanol molecular biology grade | Calbiochem | 444203 |
References
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