Reconstitución asistida por detergente de Drosophila Atlastin recombinante en liposomas para ensayos de mezcla de lípidos
Summary
La fusión de membranabiológica es catalizada por proteínas de fusión especializadas. La medición de las propiedades fusogénicas de las proteínas se puede lograr mediante ensayos de mezcla de lípidos. Presentamos un método para purificar la Drosophila atlastin recombinante, una proteína que media la fusión homotípica de la sala de urgencias, reconstituyéndola a liposomas preformados, y probando la capacidad de fusión.
Abstract
La fusión de membranas es un proceso crucial en la célula eucariota. Las proteínas especializadas son necesarias para catalizar la fusión. Las atlastinas son proteínas residentes de retículo endoplasmático (ER) implicadas en la fusión homotípica del ER. Aquí detallamos un método para purificar una glutatión S-transferasa (GST) y poli-histidina etiquetada Drosophila atlastin por dos rondas de cromatografía de afinidad. El estudio in vitro de las reacciones de fusión requiere que las proteínas de fusión purificadas se inserten en una bicapa lipídica. Los liposomas son membranas modelo ideales, ya que la composición y el tamaño de los lípidos pueden ajustarse. Con este fin, describimos un método de reconstitución mediante la eliminación de detergente para Drosophila atlastin en liposomas preformados. Si bien hay varios métodos de reconstitución disponibles, la reconstitución mediante eliminación de detergente tiene varias ventajas que lo hacen adecuado para atlastinas y otras proteínas similares. La ventaja de este método incluye un alto rendimiento de reconstitución y una orientación correcta de la proteína reconstituida. Este método se puede extender a otras proteínas de membrana y para otras aplicaciones que requieren proteoliposomas. Además, describimos un ensayo de mezcla de lípidos basado en FRET de proteoliposomas utilizados como medida de la fusión de membranas.
Introduction
La fusión de membranas es un proceso crítico en muchas reacciones biológicas. En condiciones biológicas, la fusión de membranas no es espontánea y requiere proteínas de fusión especializadas para catalizar tales reacciones1. La fusión de membrana homotípica ER está mediada en animales por la gtamin relacionada con GTPase atlastin2. El papel de Atlastin en la fusión homotípica es fundamental para las uniones de tres vías en ER periférico, que constituye una gran red interconectada de túbulos que se extienden a lo largo de la célula. Las atlastinas tienen una morfología de dominio conservada que consiste en una gran GTPase, un dominio medio de tres helix, un ancla de membrana hidrofóbica y una cola c-terminal citoplasmática corta3. Estudios in vitro con Drosophila atlastin recombinante han demostrado que cuando se reconstituye a liposomas, mantiene sus propiedades fusogénicas. Otras atlastinas, incluidos los homólogos humanos, no han podido recapitular la fusión in vitro. Aquí describimos una metodología para purificar un GST y polihistidina etiquetado sorcombinante Drosophila atlastin, reconstituirlo en liposomas, y decir fusión.
El estudio de la fusión de membrana in vitro presenta un desafío, ya que las proteínas fusogénicas suelen tener un anclaje de membrana. Para estudiarlos, es necesario reconstituirlos en bicapas de lípidos modelo. Las vesículas unilamelares grandes (LUV) son una herramienta útil para estudiar las interacciones con proteínas lipídicas. Presentamos aquí un sistema para hacer LUVs de diferentes composiciones lipídicas para la reconstitución de proteínas y ensayos de fusión. La reconstitución de proteínas integrales en LUVs puede lograrse mediante una variedad de métodos, entrelos que se incluyen la reconstitución orgánica mediada por disolventes, los mecanismos mecánicos o la reconstitución asistida por detergente 4. Aquí presentamos un método para reconstituir Drosophila atlastin en liposomas preformados mediante la eliminación de detergente. Las ventajas de este método de reconstitución incluyen altos rendimientos de reconstitución y la orientación adecuada de la atlastina en la bicapa lipídica. Además, a través de este método, la proteína no se seca ni se expone a disolventes orgánicos, manteniendo así la estructura y la función. Entre sus desventajas, la presencia de detergentes puede no ser ideal para todas las proteínas y los proteoliposomas finales pueden tener algún detergente incorporado en la bicapa lipídica. Se puede utilizar más diálisis para eliminar más detergente. Sin embargo, la diálisis puede tardar mucho tiempo y, por lo tanto, puede conducir a la pérdida de actividad proteica.
La evaluación de la actividad de fusión de atlastin se puede determinar mediante ensayos de mezcla de lípidos como se describió anteriormente2. Aquí, delineamos un método para medir la fusión mediada por atlastina a través de N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl (NBD)/Lissamine rhodamine-B sulfonyl (rhodamine) lípidos etiquetados. Este ensayo requiere la fusión de proteoliposomas de donante (etiquetados) y proteoliposomas aceptadores (sin etiquetar). Una liberación de FRET se puede medir durante la reacción como la dilución de un par donante-aceptador de liposomas “etiquetados” a liposomas “sin etiquetar” como resultado de la mezcla de lípidos durante la fusión de membranas (Figura1)5. Si bien este ensayo sirve como un proxy para la fusión de membranas, se limita a distinguir entre la fusión de membrana y la hefusión, un estado en el que sólo se mezclan los foliolos exteriores. Para abordar este problema, una alternativa es el enfriamiento externo del prospecto de NBD por ditonita. Siguiendo la misma metodología que los ensayos de mezcla de lípidos NBD/rhodamine, al poner en temple el prospecto exterior cualquier liberación de NBD FRET por fusión se deba a la mezcla interna de hilos8.
Ensayos de fusión alternativos por dirección de mezcla de contenido acuoso interno de fusión completa sólo5. Ejemplos de esto son ensayos de terbium (Tb)/ácido dipicolinico (DPA) y ensayos de ácido trisulfónico aminonaftaleno (ANTS)/p-xileno bis(piridinium) bromuro (DPX). En los ensayos Tb/DPA, un grupo de liposomas con Tb encapsulado se mezclan y se fusionan con liposomas con DPA encapsulado; tras la fusión, la fluorescencia aumenta mediante la transferencia interna de energía de DPA a Tb dentro del complejo de 3 quelaciones [Tb(DPA)3]3- complejo de quelación6. Por el contrario, para los ensayos ANTS/DPX, la fluorescencia ANTS se aplaca con DPX7. Mientras que estos sistemas abordan la mezcla de contenido interno, se requiere una preparación más profunda de los liposomas para la eliminación de reactivos no encapsulados, así como la interacción no intencional de los fluoróforos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos aquí delinean un método eficiente para purificar, reconstituir y medir la actividad de fusión de atlastina recombinante. Para garantizar altos rendimientos de atlastin funcional se deben considerar algunos pasos críticos. La expresión de atlastina debe realizarse a bajas temperaturas (16oC) para evitar la agregación y se debe apuntar a una concentración final entre 0,4-1,5 mg/ml. La proteína muy diluida no se reconstituirá de forma óptima en una proporción de proteína 1:400 a lípidos. La eficien…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Michael Stern y a su laboratorio sus ideas y comentarios sobre proyectos relacionados con atlastin. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales [R01GM101377] y el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares [R01NS102676].
Materials
| 10 mL poly-prep chromatography columns | Biored | 731-1550 | |
| 10 x 75 mm Flint glass tubes | VWR | 608225-402 | |
| 47 mm diameter, 0.45um pore whatman sterile membrane filters | Whatman | 7141 104 | |
| 96 well white plate | NUNC | 437796 | |
| Anapoe X-100 | Anatrace | 9002-931-1 | |
| Cell disrupter | Avestin | Avestin Emulsiflex C3 | |
| DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)) | Avanti | 840035P-10mg | DOPS |
| EDTA | Research organics inc. | 6381-92-6 | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Complete protease inhibitor |
| Extruder | Sigma Aldrich | Z373400 | Liposofast Basic Extruder |
| GE Akta Prime liquid chromatography system | GE Pharmacia | 8149-30-0006 | |
| Glutathione agarose beads | Sigma aldrich | G4510-50ml | |
| Glycerol | EMD | GX0185-5 | |
| GTP | Sigma Aldrich | 36051-31-7 | Guanosine 5' triphosphate sodium salt hydrate |
| HEPES, acid free | Omnipur | 5330 | |
| Imidazole | fluka | 5670 | |
| Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column | GE Healthcare | 17040801 | 1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns |
| Iohexol | Accurate chemical and scientific corporation | AN 7050 BLK | Accudenz/Nycodenz |
| IPTG | Research products international corp. | I56000-100.0 | IPTG, dioxane free |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5g | |
| Magnesium chloride | Fisher | 7791-18-6 | |
| Methanol | Omnisolv | MX0488-1 | |
| NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | NBD-DPPE |
| n-Dodecyl β-D-maltoside | Chem-Impex International | 21950 | |
| Nonpolar polystyrene adsorbent beads | BioRad | 152-3920 | SM2 Biobeads |
| Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 um pore membrane | Whatman | 800309 | |
| Optima LE80K Ultra centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Phosphatidylcholine, L-α-dipalmitoyl [choline methyl-3H] | ARC | ART0284 | Titriated lipids |
| Plate reader | TECAN | TECAN infinite M200 plate reader | |
| POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) | Avanti | 850457C-25mg | POPC |
| Potassium chloride | MP | 151944 | |
| Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | Rh-DPPE |
| Scintillation Cocktail | National Diagnostics | LS-272 | Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples |
| Scintillation vials | Beckman | 592928 | Fast turn cap Mini Poly-Q Vial |
| Thrombin | Sigma | T1063-1kU | Thrombin from human plasma |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Ultra-clear centrifuge tubes 5 x 41 mm | Beckman | 344090 | |
| Vortex 9 to 13mm Tube Holder | VWR | 58816-138 | Insert for vortexing flint glass tubes |
| Vortex Insert Retainer | VWR | 58816-132 | Retainer needed for vortex tube holder |
| Vortexer | VWR | 2.235074 | Vortex Genie 2 model G560 |
| β-mercaptoethanol molecular biology grade | Calbiochem | 444203 |
References
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