Rengörings medel-assisterad beredning av rekombinant Drosophila Atlastin i liposomer för lipid-blandning assays
Summary
Biologisk membran fusion katalyseras av specialiserade fusions proteiner. Att mäta de fusogena egenskaperna hos proteiner kan uppnås genom lipidblandningstester. Vi presenterar en metod för rening av rekombinant Drosophila atlastin, ett protein som förmedlar homotypisk fusion av ER, beredning av den till förformade liposomer, och testning för fusions kapacitet.
Abstract
Membran fusion är en avgörande process i den eukaryotiska cellen. Specialiserade proteiner är nödvändiga för att katalysera fusion. Atlastiner är endoplasmatiska Retikulum (ER) bosatta proteiner inblandade i homotypisk fusion av ER. Vi specificerar här en metod för rening av en glutation S-transferas (gst) och poly-histidin taggade Drosophila atlastin av två rundor av affinitet kromatografi. Att studera fusions reaktioner in vitro kräver att renade fusions proteiner sätts in i lipidbilayer. Liposomer är idealiska modell membran, som lipidsammansättning och storlek kan justeras. För detta ändamål beskriver vi en metod för beredning genom att ta bort rengörings medel för Drosophila atlastin i förformade liposomer. Även om flera rekonstitutionsmetoder finns tillgängliga har rekonstituering genom borttagning av rengörings medel flera fördelar som gör den lämplig för atlastiner och andra liknande proteiner. Fördelen med denna metod inkluderar en hög rekonstitutionsavkastning och korrekt orientering av det rekonstituerade proteinet. Denna metod kan utvidgas till andra membran proteiner och för andra tillämpningar som kräver proteoliposomer. Dessutom beskriver vi en FRET baserad lipid blandning test av proteoliposomer används som ett mått på membran fusion.
Introduction
Membran fusion är en kritisk process i många biologiska reaktioner. Under biologiska förhållanden är membran fusion inte spontant och kräver specialiserade fusions proteiner för att katalysera sådana reaktioner1. ER homotypisk membran fusion medieras hos djur av dynamin relaterade GTPase atlastin2. Atlastin roll i homotypisk fusion är grundläggande för tre-vägs korsningar i perifera ER, som utgör ett stort sammanlänkat nätverk av tubuli som sträcker sig över hela cellen. Atlastins har en konserveras domän morfologi bestående av en stor GTPase, en tre Helix bunt mellersta domän, en hydrofoba membran ankare, och en kort Cytoplasmatisk C-Terminal svans3. In vitro-studier med rekombinant Drosophila atlastin har visat att när rekonstitueras till liposomer, den behåller sina fusogenic egenskaper. Andra atlastiner, inklusive humana homostockar, har inte kunnat rekapitulera fusion in vitro. Vi beskriver här en metod för rening av en gst och poly-histidin taggade rekombinant Drosophila atlastin, beredning det till liposomer, och test metoder fusion.
Att studera membran fusion in vitro presenterar en utmaning som fusogenic proteiner har vanligt vis ett membran ankare. För att studera dem, är det nödvändigt att rekonstruera dem i modell lipidbilayers. Stora unilamellar blåsor (luv) är ett användbart verktyg för att studera lipidproteininteraktioner. Vi presenterar här ett system för att göra LUVs av olika lipidsammansättningar för protein beredning och fusion analyser. Rekonstituering av integralproteiner till LUVs kan uppnås genom en mängd olika metoder, inklusive organisk vätskemedierad beredning, mekaniska mekanismer, eller rengörings medels assisterad beredning4. Vi presenterar här en metod för beredning av Drosophila atlastin i förformade liposomer genom att ta bort rengörings medel. Fördelar med denna beredning metod inkluderar hög upplösning avkastning och korrekt orientering av atlastin i lipidbilayer. Dessutom, genom denna metod, är proteinet inte torkas eller utsätts för organiska lösnings medel därigenom bibehålla struktur och funktion. Bland dess nack delar, kan förekomsten av rengörings medel inte vara idealisk för alla proteiner och den slutliga proteoliposomer kan ha några inbyggda tvätt medel i lipidbilayer. Ytterligare dialys kan användas för att eliminera mer av rengörings medlet. Dialys kan dock ta lång tid och kan därför leda till förlust av protein aktivitet.
Bedöma atlastin s fusion aktivitet kan bestämmas genom lipid blandning analyser som tidigare beskrivits2. Här, vi avgränsa en metod för att mäta atlastin medierad fusion genom N-(7-nitrobenz-2-Oxa-1, 3-diazol-4-yl (NBD)/lissamin rhodamine-B Metylsulfonylmetan (rhodamine) märkta lipider. Denna analys kräver fusion av givare (märkt) proteoliposomer och tagaren (omärkta) proteoliposomer. En FRET release kan mätas under reaktionen som utspädning av en donator-Acceptor par från “märkt” liposomer till “omärkta” liposomer som ett resultat av lipidblandning under membran fusion (figur 1)5. Även denna analys fungerar som en proxy för membran fusion, det är begränsad i att skilja mellan membran fusion och hemifusion, ett tillstånd där endast de yttre broschyrer blanda. För att ta itu med detta problem är ett alternativ en ytterbipacksedel som slätar ut NBD med dithionit. Efter samma metod som för att blanda in NBD/Rhodamin-lipidblandningar, kommer alla NBD FRET-frigörningar genom fusion att på insidan av bipacksedeln blandas8.
Alternativa fusion analyser av inre vattenhaltiga innehåll blandning adress full fusion endast5. Exempel på detta är Terbium (TB)/dipicolinic Acid (DPA) analyser och Aminonaftalen trisulfonic Acid (ANTS)/p-xylene bis (pyridinium) bromid (DPX)-analyser. I TB/DPA analyser, en pool av liposomer med inkapslad TB blandas och smält med liposomer med inkapslad DPA; vid fusion ökas fluorescens via intern energi överföring från DPA till TB inom [TB (DPA)3]3- kelering Complex6. Däremot för ANTS/DPX-analyser, är ANTS fluorescens kylda av DPX7. Medan dessa system adress inre innehåll blandning, mer djupgående beredning av liposomer krävs för avlägsnande av icke-inkapslade reagenser, samt oavsiktlig interaktion av fluorophores.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoderna här avgränsar en effektiv metod för rening, beredning och mätning av fusions aktivitet av rekombinant atlastin. För att säkerställa hög avkastning av funktionella atlastin vissa kritiska steg måste övervägas. Uttryck av atlastin måste göras vid låga temperaturer (16 ° c) för att undvika agg regering och man bör sträva efter en slutlig koncentration mellan 0,4 – 1,5 mg/mL. Mycket utspädd protein kommer inte att rekonstitueras optimalt vid ett 1:400 protein-till lipidförhållande. Rekonstitu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr Michael Stern och hans labb för deras insikter och feedback på atlastin relaterade projekt. Detta arbete stöddes av det nationella institutet för allmän medicin vetenskap [R01GM101377] och det nationella institutet för neurologiska sjukdomar och stroke [R01NS102676].
Materials
| 10 mL poly-prep chromatography columns | Biored | 731-1550 | |
| 10 x 75 mm Flint glass tubes | VWR | 608225-402 | |
| 47 mm diameter, 0.45um pore whatman sterile membrane filters | Whatman | 7141 104 | |
| 96 well white plate | NUNC | 437796 | |
| Anapoe X-100 | Anatrace | 9002-931-1 | |
| Cell disrupter | Avestin | Avestin Emulsiflex C3 | |
| DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)) | Avanti | 840035P-10mg | DOPS |
| EDTA | Research organics inc. | 6381-92-6 | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Complete protease inhibitor |
| Extruder | Sigma Aldrich | Z373400 | Liposofast Basic Extruder |
| GE Akta Prime liquid chromatography system | GE Pharmacia | 8149-30-0006 | |
| Glutathione agarose beads | Sigma aldrich | G4510-50ml | |
| Glycerol | EMD | GX0185-5 | |
| GTP | Sigma Aldrich | 36051-31-7 | Guanosine 5' triphosphate sodium salt hydrate |
| HEPES, acid free | Omnipur | 5330 | |
| Imidazole | fluka | 5670 | |
| Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column | GE Healthcare | 17040801 | 1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns |
| Iohexol | Accurate chemical and scientific corporation | AN 7050 BLK | Accudenz/Nycodenz |
| IPTG | Research products international corp. | I56000-100.0 | IPTG, dioxane free |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5g | |
| Magnesium chloride | Fisher | 7791-18-6 | |
| Methanol | Omnisolv | MX0488-1 | |
| NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | NBD-DPPE |
| n-Dodecyl β-D-maltoside | Chem-Impex International | 21950 | |
| Nonpolar polystyrene adsorbent beads | BioRad | 152-3920 | SM2 Biobeads |
| Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 um pore membrane | Whatman | 800309 | |
| Optima LE80K Ultra centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Phosphatidylcholine, L-α-dipalmitoyl [choline methyl-3H] | ARC | ART0284 | Titriated lipids |
| Plate reader | TECAN | TECAN infinite M200 plate reader | |
| POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) | Avanti | 850457C-25mg | POPC |
| Potassium chloride | MP | 151944 | |
| Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | Rh-DPPE |
| Scintillation Cocktail | National Diagnostics | LS-272 | Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples |
| Scintillation vials | Beckman | 592928 | Fast turn cap Mini Poly-Q Vial |
| Thrombin | Sigma | T1063-1kU | Thrombin from human plasma |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Ultra-clear centrifuge tubes 5 x 41 mm | Beckman | 344090 | |
| Vortex 9 to 13mm Tube Holder | VWR | 58816-138 | Insert for vortexing flint glass tubes |
| Vortex Insert Retainer | VWR | 58816-132 | Retainer needed for vortex tube holder |
| Vortexer | VWR | 2.235074 | Vortex Genie 2 model G560 |
| β-mercaptoethanol molecular biology grade | Calbiochem | 444203 |
References
- Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M. Mechanics of membrane fusion. Nature Structural and Molecular Biology. 15, 675-683 (2008).
- Orso, G., et al. Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin. Nature. 460, 978-983 (2009).
- McNew, J. A., Sondermann, H., Lee, T., Stern, M., Brandizzi, F. GTP-dependent membrane fusion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 529-550 (2013).
- Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1231, 223-246 (1995).
- Düzgüneş, N. Fluorescence Assays for Liposome Fusion. Methods in Enzymology. 372, 260-274 (2003).
- Wilschut, J., Duzgunes, N., Fraley, R., Papahadjopoulos, D. Studies on the mechanism of membrane fusion: kinetics of calcium ion induced fusion of phosphatidylserine vesicles followed by a new assay for mixing of aqueous vesicle contents. 생화학. 19, 6011-6021 (1980).
- Ellens, H., Bentz, J., Szoka, F. C. Proton- and calcium-induced fusion and destabilization of liposomes. 생화학. 24, 3099-3106 (1985).
- Meers, P., Ali, S., Erukulla, R., Janoff, A. S. Novel inner monolayer fusion assays reveal differential monolayer mixing associated with cation-dependent membrane fusion. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1467, 277-243 (2000).
- Schaffner, W., Weissmann, C. A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution. Analytical Biochemistry. 56, 502-514 (1973).
- MacDonald, R. C., et al. Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles. Biochimica Et Biophysica Acta. 1061, 297-303 (1991).
- Paternostre, M. T., Roux, M., Rigaud, J. L. Mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. 1. Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100, octyl glucoside, and sodium cholate. 생화학. 27, 2668-2677 (1988).
- Scott, B. L., et al. Liposome Fusion Assay to Monitor Intracellular Membrane Fusion Machines. Methods in Enzymology. 372, 274-300 (2003).
- Zhang, W., et al. Crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association. PNAS. 114, 8550-8555 (2017).
- Parlati, F., et al. Rapid and efficient fusion of phospholipid vesicles by the α-helical core of a SNARE complex in the absence of an N-terminal regulatory domain. PNAS. 96, 12565-12570 (1999).
- Sugiura, S., Mima, J. Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p. Scientific Reports. 6, 20407 (2016).
- Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components. Nature. 543, 257-260 (2017).
- Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer. Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).
