Rekombinant Drosophila , lipid karıştırıcılar Için lipozomlar halinde deterjan destekli yeniden yapılanma
Summary
Biyolojik membran füzyon özel füzyon proteinleri tarafından katalizlenmiş. Proteinlerin fusogenik özelliklerinin ölçülmesi lipid karıştırma özellikleri ile elde edilebilir. Biz rekombinant Drosophila atlastin arındırılması için bir yöntem sunuyoruz, ER homotypic füzyon aracılık bir protein, önceden biçimlendirilmiş lipozomlar için reconstituting, ve füzyon kapasitesi için test.
Abstract
Membran füzyon ökaryotik hücrede önemli bir süreçtir. Özel proteinler füzyon katalizörler için gereklidir. Atlastins, er ‘in homottifik füzyon içinde bulunan endoplazmik retikulum (er) yerleşik proteinleridir. Biz detay burada bir glutatyon S-transferase (GST) ve Poly-histidin temizleyerek için bir yöntem benzeşme Kromatografi iki tur tarafından Drosophila atlastin etiketlenmiş. Füzyon reaksiyonları içinde vitro eğitim, lipid bilayer içine yerleştirilmek üzere arıtılmış füzyon proteinlerini gerektirir. Lipozomlar ideal model membranlara sahiptir, lipid bileşimi ve boyutu ayarlanabilir. Bu amaçla, biz önceden biçimlendirilmiş lipozomlar içine Drosophila atlastin için deterjan kaldırma ile bir reanayasa yöntemi açıklanmaktadır. Çeşitli reanayasa yöntemleri mevcut iken, deterjan kaldırma ile reanayasası atlastins ve diğer benzer proteinler için uygun hale getirmek çeşitli avantajları vardır. Bu yöntemin avantajı, reconstituted proteinin yüksek reanayasa verimi ve doğru yönünü içerir. Bu yöntem diğer membran proteinleri ve proteoliposomes gerektiren diğer uygulamalar için uzatılabilir. Ayrıca, membran füzyon ölçümü olarak kullanılan proteoliposomların bir FRET bazlı lipid karıştırma tahlili açıklanmaktadır.
Introduction
Membran füzyon birçok biyolojik reaksiyonda kritik bir süreçtir. Biyolojik koşullarda, membran füzyon spontan değildir ve bu tür reaksiyonlar katalizleştirmek için özel füzyon proteinleri gerektirir1. ER homotipik membran füzyon, Dynamin ile ilgili GTPase atlastin2‘ ye göre hayvanlarda aracılık edilir. Homotipik füzyon atlastin rolü periferik er üç yönlü kavşak için temel, hücre boyunca uzatmak tübüllerin büyük bir bağlantılı ağ oluşturmaktadır. Atlastins, büyük bir GTPase, üç sarmal paket orta etki alanı, hidrofobik membran çapa ve kısa sitoplazmik C-Terminal kuyruğu3‘ ten oluşan bir korunması alan morfolojisine sahiptir. İn vitro çalışmalar rekombinant Drosophila atlastin ile lipozomlar için reconstituted, onun fusogenic özelliklerini korur göstermiştir. İnsan homologlar da dahil olmak üzere diğer atlastins, Fusion in vitro reapitulate mümkün olmamıştır. Biz burada bir GST ve poli-histidin etiketli rekombinant Drosophila atlastin arındırmak için bir metodoloji tarif, lipozomlar için reconstituting, ve füzyon iddia.
Membran füzyon içinde vitro eğitim fusogenik proteinler genellikle bir membran çapa sahip olarak bir meydan okuma sunar. Onları incelemek için, onları model lipid bilayers içine yeniden oluşturmak için gereklidir. Büyük unilamellar veziküller (LUV) lipid protein etkileşimlerini incelemek için yararlı bir araçtır. Biz burada bir sistem protein reanayasası ve füzyon assays için farklı lipid bileşimleri LUVs yapmak için sunuyoruz. Integral proteinlerin luvs içine yeniden oluşturulması da dahil olmak üzere çeşitli yöntemlerle elde edilebilir, organik solvent aracılı reanayasa, mekanik mekanizmalar, veya deterjan destekli sulandırma4. Biz burada bir yöntem sunuyoruz Drosophila atlastin ön biçimlendirilmiş lipozomlar içine deterjan kaldırma. Bu reanayasa yönteminin avantajları yüksek reanayasa verimi ve lipid bilayer içinde atlastin uygun oryantasyonu içerir. Ayrıca, bu yöntem sayesinde, protein kurutulmaz veya organik çözücülere maruz kalmaktadır, böylece yapı ve fonksiyon sürdürüyor. Dezavantajları arasında, deterjanların varlığı tüm proteinler için ideal olmayabilir ve son proteoliposomların lipid bilayer içinde bazı entegre deterjan olabilir. Daha fazla diyaliz daha fazla deterjan ortadan kaldırmak için kullanılabilir. Ancak diyaliz uzun sürebilir ve bu nedenle protein aktivitesinin kaybına neden olabilir.
Atlastin ‘in füzyon aktivitesinin değerlendirilmesi, daha önce açıklandığı gibi lipid karıştırma kavramında belirlenir2. Burada, biz N-(7-nitrobenz-2-Oxa-1, 3-diazol-4-il (NBD)/Lissamine Rhodamine-B sülfonil (Rhodamine) etiketli lipidler yoluyla atlastin aracılı füzyon ölçmek için bir yöntem betimlemek. Bu tahlil donör (etiketli) proteoliposomes ve Acceptor (etiketlenmemiş) proteoliposomes füzyon gerektirir. Bir donörün seyreltmesi olarak reaksiyon sırasında bir FRET sürümü ölçülebilir – membran füzyon sırasında lipid karıştırma sonucunda “etiketli” lipozomlar “etiketlenmemiş” liderecede ‘ den alıcı çifti (Şekil 1)5. Bu tahlil membran füzyon için bir vekil olarak hizmet ederken, membran füzyon ve hemifüzyon arasında ayırt sınırlıdır, bir devlet nerede sadece dış broşürler karışımı. Bu sorunu gidermek için, alternatif olarak NBD ‘nin dithionite tarafından dış broşür giderici olduğunu. NBD/Rhodamine lipid karıştırma gibi aynı metodoloji takip, dış broşürün füzyon tarafından herhangi bir NBD FRET serbest Quenching üzerine iç broşür karıştırma8nedeniyle olacaktır.
Alternatif füzyon iç sulu içerik karıştırma adresi tam füzyon sadece5tarafından görülmektedir. Bu örnekler Terbiyum (TB)/dipicolinik asit (DPA) deneyleri ve aminonaphthalene trisulfonik asit (karıncalar)/p-Xylene bis (pyridinium) bromür (DPX) deneyleri. TB/DPA ‘da, kapsüllenmiş TB olan lipozomlar havuzu karışık ve kapsüllü DPA ile lipozomlar ile kaynaşıyor; Füzyon üzerine, floresans [TB (DPA)3]3- şelasyon kompleksi6içinde DPA ‘dan TB ‘ye dahili enerji aktarımı ile artar. Buna karşılık, ANTS/DPX için, ANTS floresans DPX7tarafından söndürülün. Bu sistemler iç içeriği karıştırırken, lipozomların daha derinlemesine hazırlanması, kapsüllenmeyen reaktiflerin kaldırılması ve fluorophorlerin istenmeyen etkileşimi için gereklidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Buradaki Yöntemler, rekombinant atlastin ‘in füzyon aktivitesini arındırmak, reconstituting ve ölçmek için verimli bir yöntem tarif ederler. Bazı kritik adımlarla fonksiyonel atlastin yüksek verim sağlamak için dikkate alınmalıdır. Atlastin ifadesi, toplama işleminden kaçınmak için düşük sıcaklıklarda (16 °C) yapılmalıdır ve bir adet 0.4 – 1.5 mg/mL arasında son bir konsantrasyon hedeflemelisiniz. Çok seyreltilmiş protein bir 1:400 protein lipid oranı en iyi şekilde reconstituted olmay…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Michael Stern ve laboratuvarına, atlastin ile ilgili projelerdeki görüşleri ve geribildirimlerine teşekkür ederiz. Bu çalışma ulusal genel Tıp Bilimleri Enstitüsü [R01GM101377] ve nörolojik bozukluklar ve Inme Ulusal Enstitüsü tarafından destekleniyordu [R01NS102676].
Materials
| 10 mL poly-prep chromatography columns | Biored | 731-1550 | |
| 10 x 75 mm Flint glass tubes | VWR | 608225-402 | |
| 47 mm diameter, 0.45um pore whatman sterile membrane filters | Whatman | 7141 104 | |
| 96 well white plate | NUNC | 437796 | |
| Anapoe X-100 | Anatrace | 9002-931-1 | |
| Cell disrupter | Avestin | Avestin Emulsiflex C3 | |
| DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)) | Avanti | 840035P-10mg | DOPS |
| EDTA | Research organics inc. | 6381-92-6 | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Complete protease inhibitor |
| Extruder | Sigma Aldrich | Z373400 | Liposofast Basic Extruder |
| GE Akta Prime liquid chromatography system | GE Pharmacia | 8149-30-0006 | |
| Glutathione agarose beads | Sigma aldrich | G4510-50ml | |
| Glycerol | EMD | GX0185-5 | |
| GTP | Sigma Aldrich | 36051-31-7 | Guanosine 5' triphosphate sodium salt hydrate |
| HEPES, acid free | Omnipur | 5330 | |
| Imidazole | fluka | 5670 | |
| Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column | GE Healthcare | 17040801 | 1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns |
| Iohexol | Accurate chemical and scientific corporation | AN 7050 BLK | Accudenz/Nycodenz |
| IPTG | Research products international corp. | I56000-100.0 | IPTG, dioxane free |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5g | |
| Magnesium chloride | Fisher | 7791-18-6 | |
| Methanol | Omnisolv | MX0488-1 | |
| NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | NBD-DPPE |
| n-Dodecyl β-D-maltoside | Chem-Impex International | 21950 | |
| Nonpolar polystyrene adsorbent beads | BioRad | 152-3920 | SM2 Biobeads |
| Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 um pore membrane | Whatman | 800309 | |
| Optima LE80K Ultra centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Phosphatidylcholine, L-α-dipalmitoyl [choline methyl-3H] | ARC | ART0284 | Titriated lipids |
| Plate reader | TECAN | TECAN infinite M200 plate reader | |
| POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) | Avanti | 850457C-25mg | POPC |
| Potassium chloride | MP | 151944 | |
| Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | Rh-DPPE |
| Scintillation Cocktail | National Diagnostics | LS-272 | Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples |
| Scintillation vials | Beckman | 592928 | Fast turn cap Mini Poly-Q Vial |
| Thrombin | Sigma | T1063-1kU | Thrombin from human plasma |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Ultra-clear centrifuge tubes 5 x 41 mm | Beckman | 344090 | |
| Vortex 9 to 13mm Tube Holder | VWR | 58816-138 | Insert for vortexing flint glass tubes |
| Vortex Insert Retainer | VWR | 58816-132 | Retainer needed for vortex tube holder |
| Vortexer | VWR | 2.235074 | Vortex Genie 2 model G560 |
| β-mercaptoethanol molecular biology grade | Calbiochem | 444203 |
References
- Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M. Mechanics of membrane fusion. Nature Structural and Molecular Biology. 15, 675-683 (2008).
- Orso, G., et al. Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin. Nature. 460, 978-983 (2009).
- McNew, J. A., Sondermann, H., Lee, T., Stern, M., Brandizzi, F. GTP-dependent membrane fusion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 529-550 (2013).
- Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1231, 223-246 (1995).
- Düzgüneş, N. Fluorescence Assays for Liposome Fusion. Methods in Enzymology. 372, 260-274 (2003).
- Wilschut, J., Duzgunes, N., Fraley, R., Papahadjopoulos, D. Studies on the mechanism of membrane fusion: kinetics of calcium ion induced fusion of phosphatidylserine vesicles followed by a new assay for mixing of aqueous vesicle contents. 생화학. 19, 6011-6021 (1980).
- Ellens, H., Bentz, J., Szoka, F. C. Proton- and calcium-induced fusion and destabilization of liposomes. 생화학. 24, 3099-3106 (1985).
- Meers, P., Ali, S., Erukulla, R., Janoff, A. S. Novel inner monolayer fusion assays reveal differential monolayer mixing associated with cation-dependent membrane fusion. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1467, 277-243 (2000).
- Schaffner, W., Weissmann, C. A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution. Analytical Biochemistry. 56, 502-514 (1973).
- MacDonald, R. C., et al. Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles. Biochimica Et Biophysica Acta. 1061, 297-303 (1991).
- Paternostre, M. T., Roux, M., Rigaud, J. L. Mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. 1. Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100, octyl glucoside, and sodium cholate. 생화학. 27, 2668-2677 (1988).
- Scott, B. L., et al. Liposome Fusion Assay to Monitor Intracellular Membrane Fusion Machines. Methods in Enzymology. 372, 274-300 (2003).
- Zhang, W., et al. Crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association. PNAS. 114, 8550-8555 (2017).
- Parlati, F., et al. Rapid and efficient fusion of phospholipid vesicles by the α-helical core of a SNARE complex in the absence of an N-terminal regulatory domain. PNAS. 96, 12565-12570 (1999).
- Sugiura, S., Mima, J. Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p. Scientific Reports. 6, 20407 (2016).
- Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components. Nature. 543, 257-260 (2017).
- Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer. Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).
