통합 셀 조작 플랫폼은 주변 조건하에서 개별 현탁액 셀의 온라인 분석을 위한 단일 프로브 질량 분석 설정과 함께 사용하기 위해 개발되었습니다.
단세포 질량 분석법(SCMS)을 통해 개별 세포 수준에서 광범위한 세포 종을 감지하고 정확하게 분석할 수 있습니다. 마이크로 스케일 샘플링 및 이온화 장치인 단일 프로브는 주변 조건하에서 세포 성분에 대한 온라인, 신속한 SCMS 분석을 위한 질량 분석기와 결합될 수 있습니다. 이전에는 단일 프로브 SCMS 기술을 주로 기판에 고정된 세포를 측정하여 연구를 위한 세포 유형을 제한하는 데 사용되었습니다. 현재 연구에서, 단일 프로브 SCMS 기술은 세포 조작 시스템과 통합되어 있으며, 일반적으로 체외 수정에 사용된다. 이 통합 된 세포 조작 및 분석 플랫폼은 세포 선택 프로브를 사용하여 식별 된 개별 부동 세포를 캡처하고 마이크로 스케일 용해를위한 단일 프로브 팁으로 세포를 전송한 다음 즉각적인 질량 분석 분석을 수행합니다. 이 포획 및 전달 프로세스는 질량 분석 분석에서 매트릭스 분자의 도입을 최소화하면서 분석 전에 주변 용액에서 세포를 제거합니다. 이 통합 된 설정은 체액 샘플 (예 : 소변, 혈액, 타액 등)에 존재하는 표적 환자 분리 세포의 SCMS 분석을 가능하게하여 인간 의학 및 질병 생물학에 SCMS 분석을 잠재적으로 적용 할 수 있습니다.
인간 생물학, 특히 질병 생물학은 개별 세포의 수준에 있는 활동의 결과로 점점 이해되고 있습니다, 그러나 액체 크로마토그래피 질량 분석법 (LCMS)와 같은 전통적인 분석 방법은 일반적으로 분석하기 위하여 이용됩니다 취득한 분자 정보가 개별 세포 수준에 화학 프로세스를 정확하게 나타낼 수 없는 반면, 세포의 인구에서 준비된 견본은. 이러한 표준, 전통적인 방법은 분석 측정에 대한 세포 이질성의 영향을 분별 할 수 없으며, 세포를 파괴하고 혼합하여 포식을 준비하는 과정은 잠재적으로 세포의 변경 또는 손실로 이어집니다. 구성요소 1,2. 전통적인 방법의 이 제한은 얻어진 견본이 많은 다른 세포 모형의 복잡한 혼합물을 포함할 수 있는 참을성 있는 세포의 분석에서 특히 중요합니다. 이러한 결핍을 극복하기 위해 단일 세포 질량 분석법(SCMS) 방법을 포함한 단일 세포 분자 분석 방법이 점점 더 개발되고 있으며, 특히 세포 대사 산물과 낮은 분자량의 생물 분석에 적용되고 있습니다. 생체 분자3,4.
첫번째 SCMS 기술은 비 주변 조건2,5,6,7,8,9에서 분석을 수행하기 위해 진공 기반 기술을 사용했습니다. 10,11. 비주변 SCMS 기술은 세포 지질 및 대사 산물을 분석할 수 있지만 인공 조건하에서 시료 전처리가 필요하므로 실시간 분석에 적합하지 않습니다. 비주변 분석을 위한 샘플 준비 과정에는 매트릭스 성분의 첨가가 포함되며, 이러한 제제는 그들의 자연 환경으로부터 세포 성분을 변화시킬 수 있다12. 따라서 샘플링 환경에 대한 진공이 필요하지 않은 주변 질량 분석법(MS) 기술은 거의 기본 환경에 있는 세포를 분석하는 데 활용됩니다. 진공 환경이 없는 경우 실험 설계에서 다재다능함이 가능합니다. 카메라는 셀룰러 공정을 모니터링하기 위해 추가 될 수 있으며 부드러운 이온화 기술은 각단일 세포 실험 4,12,13에서 더 나은 정보를 수신하기 위해 분리 기술과 결합 될 수있다 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32,33,34,35,36,37,38,39,40 ,41,42.
단일 프로브 SCMS 방법은 거의 네이티브 환경에서 살아있는 포유류 암 세포주를 분석하는 주변 기술이다21,43,44,45,46. 또한, 단일 프로브 장치는 다세포 스페로이드에서 세포외 분자의 분석및 조직의 MS 이미징을 포함한 다른 질량 분석 응용 분야에 사용되어 왔으며47,48,49 ,50,51,52. 그러나, 이 방법에는 기판상 세포 고정이 필요하기 때문에, 현탁액세포는 이 기술을 사용하여 직접 분석될 수 없다 3,53. 따라서, 단일 프로브 SCMS 시스템은 환자의 혈액 또는 다른 체액으로부터 분리된 비부착 세포주 또는 현탁액 세포와 같은 비부착 단일 세포를 시료화하기 위해 직접 사용될 수없었다(54) 이 작업에서, 통합 된 세포 조작 플랫폼 (ICMP)은 최소한의 샘플 준비와 온라인 라이브, 현탁액 세포를분석하는 단일 프로브 SCMS 기술과 결합 (도 1)46. ICMP는 세포 선택을 모니터링하는 반전 된 현미경, 유리 셀 선택 프로브, 개별 부동 세포를 캡처하는 마이크로 인젝터, 세포 온도를 유지하는 가열 플레이트, 공간 제어를위한 두 개의 세포 조작 시스템으로 구성됩니다. 유리 셀 선택 프로브와 단일 프로브, 그리고 셀 선택 프로브 팁에서 단일 프로브 팁으로의 세포 전달을 관찰하는 디지털 현미경의 움직임. 단일 프로브의 제작은 이전 간행물에서 자세히 설명되어 있으며 여기서21,48로다루지 않습니다. ICMP/단일 프로브 시스템은 고분해능 질량 분석기와 결합됩니다. 이 통합 된 설정은 매트릭스 분자에서 최소한의 효과와 복잡한 생물학적 샘플에서 확인 된 단일 세포의 샘플링을 할 수 있습니다.
통합 된 셀 조작 및 분석 플랫폼은 단일 프로브 MS 방법의 다양성을 확장하도록 구성되어 거의 기본 환경에서 비 부착 셀을 온라인, 신속하게 분석 할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 최소한의 시료 전처리가 필요하므로 세포가 표준 상태를 모방하는 조건에서 분석된다는 것입니다. 특히, 관심 있는 개별 세포를 시각적으로 식별하고 선택할 수 있어 자연 환경에서 세포를 유지하면서 MS 이온화 효율에 대한 매트릭스 효과의 영향을 최소화할 수 있으므로 그 결과는 보다 대표적인 세포의 기본 세포입니다. 상태(그림S3)를참조하십시오. 이 기술은 잠재적으로 미래 연구에서 생체 유체에 중단 된 환자 세포를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 또 다른 장점은 샘플링 용매의 유연한 선택입니다. 미세 스케일 용해가 빠르게 발생할 수 있도록 주요 샘플링 용매로 아세토니트릴을 포함하는 것이 중요합니다. 잠재적으로, 내부 표준(예를 들어, 동위원소 표지된 약물 화합물)은 개별 세포로부터 관심 있는 분자(예를 들어, 약물 분자)의 정량화를 위한 샘플링 용매에 첨가될 수 있으며, 이를 포함하여 혁명에 중요한 역할을 할 수 있다. 향후 약물 치료 개인화54.
이 통합 시스템은 광범위한 셀을 분석하는 데 편리하게 사용될 수 있지만, 방법의 한계는 단일 프로브 또는 셀 선택 프로브가 시판되지 않는다는 것입니다. 각 실험 에 앞서 많은 파라미터(예: 유량, 전압, 나노 ESI 방사체 및 이온 전달 튜브 사이의 길이)의 최적화필요성을 지시한다. 또한, 단일 프로브 및 셀 선택 프로브의 소박함으로 인해 환경 적 동요(예를 들어, 공기 흐름)는 두 프로브 사이의 접합을 확립하는 데 어려움을 초래할 수 있다. 단기 용액은 테이핑 길이를 최소화하기 위해 종단에 가까운 셀 선택 프로브의 굽힘입니다. 향후 작업에는 환경 영향을 최소화하기 위해 설정의 중요한 부분을 둘러싸는 주택 개발이 포함됩니다. 세포에서 세포 내용물의 제한된 양과 짧은 수집 시간 (~ 2-3 s)으로 인해 MS / MS 분석은 상대적으로 풍부한 종에 대해서만 수행 될 수 있습니다. 검출 감도에 영향을 미치는 다른 요인으로는 확장된 이온 전달 튜브를 통한 전지 및 잠재적 이온 손실과 함께 매트릭스의 도입으로 인한 억제된 이온화 효율이 포함됩니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 현탁액 세포와 세포 용해 실험 모두에 대한 샘플 준비를 개발하는 그녀의 작품에 대한 나가 라마 Kothapalli 감사합니다. 또한, 저자는 자금 에 대한 NIH (R01GM116116 및 R21CA204706)에 감사드립니다.
Acetontrile | Millipore Co. | AX0145-1 | Sampling solvent |
CellTram Vario | Eppendorf | 6221 | ICMP |
Copper wire | stores.ebay.com/jewelerheaven | Dead soft, round, 20 guage, 25 ft | Conductive union setup |
Digital stereomicroscope | Shenzhen D&F Co. | Supereyes T004 | Analysis |
Disposable micropipette, 1-5 µL | Rochester Scientific | 5065 | Cell-selection probe fabrication |
Dual bore quartz tubing, 1.120"x0.005"x12" | Friedrich & Dimmock, Inc. | MBT-005-020-2Q | Single-probe fabrication |
Epoxy resin | Devcon | Part No. 20945 | Single-probe fabrication |
Eppendorf cell manipulation system | Eppendorf | Transferman NK517800397-U.R. | ICMP |
External nut | VALCO*CHEMINERT | EN1 | Ion transfer tube fabrication |
Formic acid | Sigma-Aldrich | 399388-500ML | Sampling solvent |
Fused silica capillary, ID: 40 µm, OD: 100 µm | Polymicro Technologies | TSP040105 | Single-probe fabrication, conductive union setup |
Fused silica capillary, ID: 50 µm, OD: 150 µm | Polymicro Technologies | 1068150015 | Conductive union setup |
HyClone Synthetic fetal bovine serum (FBS) | Fischer Sci | SH3006603 | Cell culture |
Inline MicroFilter | IDEX Health & Science LLC | M-520 | Conductive union setup |
Laser puller | Sutter Instrument Co. | Model P-2000 | Single-probe fabrication |
LED UV lamp | Foshan Liang Ya Dental Equipment | LY-C240 | Single-probe fabrication |
LTQ Orbitrap mass spectrometer | Thermo Scientific | LTQ Orbitrap XL | Analysis |
Microforge | Narishige, Co. | MF-9 | Cell-selection probe fabrication |
Microunion | IDEX Health & Science LLC | M-539 | Conductive union |
PEEK tubing, 1/32×0.005x 5ft | IDEX Health & Science LLC | 1576 | Conductive union setup |
PEEK tubing, 1/32×0.007x 5ft | IDEX Health & Science LLC | 1577 | Conductive union setup |
Penicillin/Streptomycin | Gibco/Life Technologies | 15140-122 | Cell culture |
Petri dish, 35×10 mm | VWR | 25382-334 | Sample preparation |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | VWR | 0780-50L | Cell culture |
Platinum wire | Narishige, Co. | Model PT-A | Microforge |
Power supply | Nikon | PSM-2120 | ICMP |
RPMI, 1X with Corning glutagro | Corning | 10-104-CV | Cell culture |
Single-bore tubes | Boralex | 5065 | Cell-selection probe fabrication |
Stainless steel ferrules, for 1/16" OD | IDEX Health & Science LLC | VHP-200-01x | Ion transfer tube fabrication |
Stainless steel tubing, 1/32x 205 µm x30 cm | IDEX Health & Science LLC | U-1128 | Ion transfer tube fabrication |
Syringe, 250 µL | Hamilton | 1725LTN250UL | Sampling syringe |
T25 flask | CellStar | 690160 | Cell culture |
Thermo LTQ XL ion source interface flange | New Objective | PB5500 | Analysis |
ThermoPlate | TokaiHit | 55R30N | ICMP |
TrypLE Express | Gibco | 12605-010 | Cell culture |
Tube cutter, for 1/16" stainless steel | SUPELCO | 58692-U | Ion transfer tube fabrication |
USB digital photography microscope | dx.com | SO2 25~500X | Analysis |
UV curing resin | Prime Dental | Item No. 006.030 | Single-probe fabrication |
Vertical pipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | Cell-selection probe fabrication |
Voltage housing | PicoChip | PCH-A00120 | ICMP/MS interface |
Wire cutter | Craftsman | 4 1/2 in end nipper | Conductive union setup |