开发了一个集成的细胞操作平台,用于与单探针质谱设置结合使用,用于在环境条件下对单个悬浮单元进行在线分析。
单细胞质谱法(SCMS)能够对单个细胞水平上广泛的细胞物种进行灵敏的检测和准确分析。单探头,一个微尺度采样和电光装置,可以配合质谱仪在线,快速SCMS分析细胞成分的环境条件。以前,单探针SCMS技术主要用于测量固定在基板上的细胞,限制用于研究的细胞类型。在目前的研究中,单探针SCMS技术已与细胞操作系统集成,通常用于体外受精。此集成的细胞操作和分析平台使用细胞选择探针捕获已识别的单个浮细胞,并将细胞转移到微尺度分解的单探针尖端,然后立即进行质谱分析。这种捕获和转移过程在分析之前从周围的溶液中去除细胞,最大限度地减少了质谱分析中基质分子的引入。这种集成设置能够分析体液样本(如尿液、血液、唾液等)中存在的靶向患者分离细胞的SCMS分析,从而允许SCMS分析在人类医学和疾病生物学中的潜在应用。
人类生物学,特别是疾病生物学,越来越被理解为单个细胞水平上活动的结果,但传统的分析方法,如液相色谱质谱法(LCMS),通常被用来分析从细胞群制备的样本,而获得的分子信息不能准确表示单个细胞层面的化学过程。这些标准,传统方法无法辨别细胞异质性对分析测量的影响,以及破坏和混合细胞制备解热剂的过程可能导致细胞的改变或损失组件1,2.传统方法的这些局限性在分析患者细胞时尤为重要,在分析患者细胞时,获得的样本可以包含许多不同细胞类型的复杂混合物。为了克服这些缺陷,单细胞分子分析方法,包括单细胞质谱法(SCMS)方法,正在越来越多地被开发并应用于生物分析,特别是细胞代谢物和低分子量生物分子3,4。
第一批SCMS技术开发使用真空技术,在非环境条件下执行分析2,5,6,7,8,9, 10,11.非环境SCMS技术能够分析细胞脂质和代谢物,但在人工条件下需要样品预处理,因此不适合实时分析。非环境分析的样品制备过程包括添加基质成分,这种制备可以改变细胞成分从自然环境12。因此,环境质谱 (MS) 技术(对于采样环境不需要真空)用于分析接近原生环境中的细胞。没有真空环境,实验设计具有多功能性;可以添加摄像头来监控细胞过程,软电离技术可以与分离技术相结合,从每个单细胞实验4、12、13中接收更好的信息。 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32,33,34,35,36,37,38,39,40 ,41,42.
单探针SCMS方法是一种环境技术,分析近原生环境中的活哺乳动物癌细胞系21,43,44,45,46。此外,单探针装置还用于其他质谱学应用,包括多细胞球体细胞外分子分析以及组织47、48、49的MS成像 ,50,51,52.然而,由于这种方法需要在基质上进行细胞固定,因此不能直接使用这种技术3,53分析悬浮细胞。因此,单探针SCMS系统不能直接用于样品非粘附单细胞,如从患者血液或其他体液中分离的非粘附细胞系或悬浮细胞54。在这项工作中,集成细胞操作平台(ICMP)与单探针SCMS技术相结合,以最少的样品制备在线分析活的悬浮细胞(图1)46。ICMP 包括一个倒置显微镜来监测细胞选择,一个玻璃细胞选择探头,一个用于捕获单个浮动细胞的显微注射器,一个用于保持细胞温度的加热板,两个细胞操作系统来控制空间玻璃细胞选择探针和单探针的运动,以及数字显微镜的运动,以观察细胞从细胞选择探针尖端到单探针尖端的细胞转移。单探的制作在以前的出版物中已详细说明,不会在此讨论21,48。ICMP/单探头系统与高分辨率质谱仪耦合。这种集成设置允许从复杂的生物样本中取样识别的单个细胞,而基质分子的影响最小。
集成的细胞操作和分析平台旨在扩展单探针MS方法的多功能性,允许在接近原生环境中对非粘附细胞进行在线、快速分析。该技术的一个主要优点是,需要最少的样品制备,因此在模拟其标准状态的条件下分析细胞。特别是,可以直观地识别和选择感兴趣的单个细胞,将基质效应对MS电化效率的影响降至最低,同时保持细胞在自然环境中,因此其结果是更具代表性的细胞的原生状态 (图 S3)。该技术可能用于研究悬浮在生物液体中的患者细胞,该技术的另一个优点是灵活选择取样溶剂。将醋酸酯作为主要取样溶剂非常重要,以便迅速发生微尺度溶解。内部标准(例如,异位标记药物化合物)可能添加到取样溶剂中,用于定量单个细胞的感兴趣的分子(例如药物分子),包括那些可在革命中发挥关键作用的分子。个性化药物治疗在未来54。
虽然这个集成系统可以很方便地用于分析广泛的细胞范围,但该方法的一个局限性是,单探针和单元选择探头都不具有商业用途;在每次实验之前,需要优化许多参数(例如,流速、电压、纳米ESI发射器和电传递管之间的长度等)。此外,由于单探针和细胞选择探头的体积小,环境扰动(例如气流)可能会导致难以在两个探头之间建立连接。短期解决方案是将细胞选择探头弯曲到接近末端,以尽量减少锥形的长度。今后的工作包括开发一个住房,以包围设置的关键部分,以尽量减少对环境的影响。由于细胞含量有限,从细胞获取时间短(±2-3s),MS/MS分析只能对相对丰富的物种进行。影响检测灵敏度的其他因素包括由于引入基质以及细胞和通过扩展的电传递管而潜在的电因损失而抑制的电化效率。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢那加拉马·科塔帕利在为悬浮细胞和细胞莱沙实验开发样品制备方面所做的工作。此外,作者感谢NIH(R01GM116116和R21CA204706)的资助。
Acetontrile | Millipore Co. | AX0145-1 | Sampling solvent |
CellTram Vario | Eppendorf | 6221 | ICMP |
Copper wire | stores.ebay.com/jewelerheaven | Dead soft, round, 20 guage, 25 ft | Conductive union setup |
Digital stereomicroscope | Shenzhen D&F Co. | Supereyes T004 | Analysis |
Disposable micropipette, 1-5 µL | Rochester Scientific | 5065 | Cell-selection probe fabrication |
Dual bore quartz tubing, 1.120"x0.005"x12" | Friedrich & Dimmock, Inc. | MBT-005-020-2Q | Single-probe fabrication |
Epoxy resin | Devcon | Part No. 20945 | Single-probe fabrication |
Eppendorf cell manipulation system | Eppendorf | Transferman NK517800397-U.R. | ICMP |
External nut | VALCO*CHEMINERT | EN1 | Ion transfer tube fabrication |
Formic acid | Sigma-Aldrich | 399388-500ML | Sampling solvent |
Fused silica capillary, ID: 40 µm, OD: 100 µm | Polymicro Technologies | TSP040105 | Single-probe fabrication, conductive union setup |
Fused silica capillary, ID: 50 µm, OD: 150 µm | Polymicro Technologies | 1068150015 | Conductive union setup |
HyClone Synthetic fetal bovine serum (FBS) | Fischer Sci | SH3006603 | Cell culture |
Inline MicroFilter | IDEX Health & Science LLC | M-520 | Conductive union setup |
Laser puller | Sutter Instrument Co. | Model P-2000 | Single-probe fabrication |
LED UV lamp | Foshan Liang Ya Dental Equipment | LY-C240 | Single-probe fabrication |
LTQ Orbitrap mass spectrometer | Thermo Scientific | LTQ Orbitrap XL | Analysis |
Microforge | Narishige, Co. | MF-9 | Cell-selection probe fabrication |
Microunion | IDEX Health & Science LLC | M-539 | Conductive union |
PEEK tubing, 1/32×0.005x 5ft | IDEX Health & Science LLC | 1576 | Conductive union setup |
PEEK tubing, 1/32×0.007x 5ft | IDEX Health & Science LLC | 1577 | Conductive union setup |
Penicillin/Streptomycin | Gibco/Life Technologies | 15140-122 | Cell culture |
Petri dish, 35×10 mm | VWR | 25382-334 | Sample preparation |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | VWR | 0780-50L | Cell culture |
Platinum wire | Narishige, Co. | Model PT-A | Microforge |
Power supply | Nikon | PSM-2120 | ICMP |
RPMI, 1X with Corning glutagro | Corning | 10-104-CV | Cell culture |
Single-bore tubes | Boralex | 5065 | Cell-selection probe fabrication |
Stainless steel ferrules, for 1/16" OD | IDEX Health & Science LLC | VHP-200-01x | Ion transfer tube fabrication |
Stainless steel tubing, 1/32x 205 µm x30 cm | IDEX Health & Science LLC | U-1128 | Ion transfer tube fabrication |
Syringe, 250 µL | Hamilton | 1725LTN250UL | Sampling syringe |
T25 flask | CellStar | 690160 | Cell culture |
Thermo LTQ XL ion source interface flange | New Objective | PB5500 | Analysis |
ThermoPlate | TokaiHit | 55R30N | ICMP |
TrypLE Express | Gibco | 12605-010 | Cell culture |
Tube cutter, for 1/16" stainless steel | SUPELCO | 58692-U | Ion transfer tube fabrication |
USB digital photography microscope | dx.com | SO2 25~500X | Analysis |
UV curing resin | Prime Dental | Item No. 006.030 | Single-probe fabrication |
Vertical pipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | Cell-selection probe fabrication |
Voltage housing | PicoChip | PCH-A00120 | ICMP/MS interface |
Wire cutter | Craftsman | 4 1/2 in end nipper | Conductive union setup |