Detta protokoll beskriver en reproducerbar metod för isolering av mus rabdomyosarkom primära celler, tumorsphere formation och behandling, och transplantatavstötning transplantation från tumorspheres kulturer.
Rhabdomyosarcoma (RMS) är den vanligaste mjukdelssarkom hos barn. Även om betydande insatser har möjliggjort identifiering av vanliga mutationer i samband med RMS och tillåten diskriminering av olika RMS-subtyper, finns det fortfarande stora utmaningar för utvecklingen av nya behandlingar för att ytterligare förbättra prognosen. Även identifieras genom uttrycket av myogena markörer, det finns fortfarande betydande kontrovers om huruvida RMS har Myogenic eller icke-Myogenic ursprung, som cellen ursprung är fortfarande dåligt förstått. I den aktuella studien finns en tillförlitlig metod för tumorsphere-analysen för mus RMS. Analysen är baserad på funktionella egenskaper tumörceller och gör det möjligt att identifiera sällsynta populationer i tumören med tumörframkallande funktioner. Beskrivs också är procedurer för att testa rekombinanta proteiner, integrera transfektion protokoll med tumorsphere assay, och utvärdera kandidat gener involverade i tumörutveckling och tillväxt. Beskrivs vidare är ett förfarande för transplantatavstötning transplantation av tumorspheres till mottagar möss att validera tumörframkallande funktion in vivo. Sammantaget ger den beskrivna metoden tillförlitlig identifiering och testning av sällsynta RMS-tumorigena populationer som kan tillämpas på RMS som uppstår i olika sammanhang. Slutligen kan protokollet utnyttjas som en plattform för läkemedels screening och framtida utveckling av Therapeutics.
Cancer är en heterogen sjukdom; Dessutom, samma typ av tumör kan presentera olika genetiska mutationer hos olika patienter, och inom en patient en tumör består av flera populationer av celler1. Heterogenitet utgör en utmaning i identifieringen av celler som ansvarar för att initiera och sprida cancer, men deras karakterisering är avgörande för utvecklingen av effektiva behandlingar. Begreppet tumör föröknings celler (TPC), en sällsynt population av celler som bidrar till tumörutveckling, har tidigare utförligt granskats2. Trots det faktum att tpcs har karakteriserats i flera typer av cancer, är identifieringen av markörer för deras pålitliga isolering en utmaning för flera tumörtyper3,4,5,6 , 7 , 8 , 9. sålunda, en metod som inte förlitar sig på molekylära markörer utan snarare på TPC funktionella egenskaper (hög självförnyelse och förmågan att växa i låg-tillbehör villkor), känd som tumorsphere formation assay, kan tillämpas i stor utsträckning för identifiering av TPCs från de flesta tumörer. Viktigt, denna analys kan också användas för utbyggnad av tpcs och därmed direkt tillämpas på cancer Drug screening och studier om cancer resistens1,10.
Rhabdomyosarcoma (RMS) är en sällsynt form av mjukdelssarkom vanligast hos små barn11. Althoug RMS kan histologiskt identifieras genom bedömning av uttrycket av myogena markörer, har RMS-cellen av ursprung inte univokala kännetecknas på grund av de multipla tumör subtyper och hög heterogenitet av tumörutveckling stimuli. Nyligen genomförda studier har genererat en betydande vetenskaplig diskussion om huruvida RMS är av myogent eller icke-myogent ursprung, vilket tyder på att RMS kan härledas från olika celltyper beroende på sammanhanget12,13, fjorton , 15 , 16 , 17. ett flertal studier på RMS cellinjer har utförts med hjälp av tumorsphere formation analys för identifiering av vägar som är involverade i tumörutveckling och karakterisering av markörer i samband med mycket självförnyelse populationer 18 , 19 , 20 , 21.
Men trots tumorsphere formation assay potential för att identifiera RMS-celler ursprung, en tillförlitlig metod som kan användas på primära RMS-celler har ännu inte beskrivits. I detta sammanhang, en nyligen studie från vår grupp anställd en optimerad tumorsphere formation analys för identifiering av RMS-celler ursprung i en Duchennes muskeldystrofi (DMD) musmodell22. Flera pre-tumorigena celltyper, isolerade från muskelvävnad, testas för sin förmåga att växa i låg-tillbehör villkor, så att identifieringen av muskelstamceller som celler av ursprung för RMS i dystrofa sammanhang. Beskrivs här är ett reproducerbart och tillförlitligt protokoll för tumorsphere formation assay (figur 1), som har framgångsrikt använts för identifiering av extremt sällsynta cellpopulationer som är ansvariga för mus RMS utveckling.
Flera metoder har använts för isolering och karakterisering av tpcs från tumör heterogena cellpopulationer: tumör klonogena assays, FACS isolering och tumorsphere formation assay. Tumören klonogena analysen beskrevs första gången i 1971, används för stamcells studier, och först därefter tillämpas på cancerbiologi29,30. Denna metod är baserad på cancer stamcells inneboende egenskapen att expandera utan begränsningar i mjuka geler kulturer<sup clas…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Ellison Medical Foundation Grant AG-NS-0843-11, och NIH pilot Grant inom NCI Cancer Center support Grant P30CA030199 till A.S.
Accutase cell dissociation reagent | Gibco | A1110501 | Detach adherent cells and dissociate tumorspheres |
Celigo | Nexcelom | Celigo | Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells |
Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101015 | Tissue digestion enzyme |
Dispase II, protease | Life Technologies | 17105041 | Tissue digestion enzyme |
DMEM high glucose media | Gibco | 11965092 | Component of tumor cells media |
DMEM/F12 Media | Gibco | 11320033 | Component of tumosphere media |
EDTA | ThermoFisher | S312500 | Component of FACS buffer |
EGF recombinant mouse protein | Gibco | PMG8041 | Component of tumosphere media |
FACSAria II Flow Cytometry | BD Biosciences | 650033 | Fluorescent activated cell sorter |
Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-11 | Component of tumor cells media |
Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthetic reagent for animals |
FxCycle Violet Stain | Life Technologies | F10347 | Discriminate live and dead cells |
Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | Component of FACS buffer |
Ham's F10 Media | Life Technologies | 11550043 | Component of FACS buffer |
Horse Serum | Life Technologies | 16050114 | Component of cell isolation media |
Lipofectamine 3000 transfection reagent | ThermoFisher | L3000015 | Transfection Reagent |
Matrigel membrane matrix | Corning | CB40234 | Provides support to trasplanted cells |
N-2 Supplemtns (100X) | Gibco | 17502048 | Component of tumosphere media |
Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment | MWI Vet Supply | 701008 | Eyes ointment |
PBS | Gibco | 10010023 | Component of FACS buffer and used for washing cells |
pEGFP-C1 | Addgene | 6084-1 | GFP plasmid |
Penicillin – Streptomyocin | Life Technologies | 15140163 | Component of tumosphere and tumor cells media |
Recombinant Human βFGF-basic | Peprotech | 10018B | Component of tumosphere media |
Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 427-FL-005 | Recombinant protein |
Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | Discriminate live and dead cells |