צינור מלא לבידוד ולרצף של מיקרו-משתמשים וניתוחם באמצעות כלי קוד פתוח
Summary
כאן, אנו מתארים אסטרטגיה צעד אחר צעד עבור בידוד RNAs קטנים, העשרת עבור microRNAs, והכנת דגימות עבור רצף תפוקה גבוהה. לאחר מכן נתאר כיצד לעבד רצף וליישר אותם ל-microRNAs, באמצעות כלי קוד פתוח.
Abstract
חצי מכל התעתיקים האנושיים נחשבים למווסתים על ידי מיקרו-נאס. לפיכך, ביטוי המונח מיקרואורנה יכול לחשוף את המנגנונים הבסיסיים במצבי מחלה ולספק מטרות טיפוליות וביטויים. כאן, אנו מפרטים כיצד לכמת במדויק microRNAs. בקצרה, שיטה זו מתארת את הבידוד של microRNAs, מחברת אותם למתאמים המתאימים לרצפי התפוקה הגבוהה, מגביר את המוצרים הסופיים ומכינים ספריה לדוגמה. לאחר מכן נסביר כיצד ליישר את הרצף המתקבל לסיכות השיער, ולכמת, לנרמל ולחשב את הביטוי הדיפרנציאלי שלהם. מגוונת ואיתנה, תהליך העבודה הניסיוני המשולב וניתוח ביולוגי מאפשר למשתמשים להתחיל בהפקת רקמות ולסיים עם כימות הכמת של מיקרואורנה.
Introduction
התגלה לראשונה ב 19931, כעת מוערך כי כמעט 2000 microRNAs נמצאים בגנום האדם2. MicroRNAs הם קטנים שאינם קידוד RNAs כי הם בדרך כלל 21-24 נוקלאוטידים ארוך. הם הרגולטורים לאחר ההמרה של ביטוי גנים, לעתים קרובות מחייב לאתרים המשלימים באזור 3-untranslated (3-UTR) של גנים היעד כדי לדכא את הביטוי חלבון לבזות mRNA. כימות מיקרו-משתמשים יכולים לתת תובנה רבת ערך לביטוי גנים ופרוטוקולים מספר פותחו למטרה זו3.
פיתחנו פרוטוקול מוגדר, מיובן וארוך לרצפי RNA קטנים, ולניתוח קריאות מנורמלות באמצעות כלים ביואינפורמטיקה בקוד פתוח. חשוב מכך, הפרוטוקול שלנו מאפשר את הזיהוי הסימולטני של שני המבנים האנדוגניים והמוצרים שנמסרו באופן שונה המייצרים מינים של מיקרוני אורנה, בעוד הפחתת קריאות המפה למיני RNA קטנים אחרים, כולל RNAs ( rRNAs), העברת מוצרים קטנים (tsRNAs) מתוצרת RNA, מוצרי השפלה קטנים והשפלות של mRNA. למרבה המזל, microRNAs הם 5-זרחליום ו-2-3 הphosphorylated4, תכונה זה יכול להיות ממונפת כדי להפריד אותם ממוצרי rnas קטנים אחרים mrna השפלה. מספר אפשרויות מסחריות קיימות עבור שיבוט ורצפי מיקרואורנה, שלעיתים קרובות מהיר וקל יותר לקולנוע; עם זאת, האופי הקנייני של ריאגנטים קיט ושינויים תכופים שלהם עושה השוואת מדגם פועל מאתגרת. האסטרטגיה שלנו ממטבת איסוף רק את הגודל הנכון של microRNAs באמצעות אקרילide ו agarose ג’ל שלבי הטיהור. בפרוטוקול זה, אנו מתארים גם פרוצדורה ליישור קריאות רצף ל-microRNAs באמצעות כלי קוד פתוח. קבוצה זו של הוראות תהיה שימושית במיוחד עבור משתמשי אינפורמטיקה מתחילים, בין אם שיטת ההכנה של הספרייה שלנו או שיטה מסחרית משמש.
פרוטוקול זה נעשה בשימוש במספר מחקרים שפורסמו. לדוגמה, הוא שימש כדי לזהות את המנגנון שעליו האנזים Dicer משאיר הקטן RNAs במרחק של שני נוקלאוטידים מן הלולאה הפנימית של מבנה לולאה גזע-כביכול “החוק ספירת לולאה”5. אנו גם בעקבות שיטות אלה כדי לזהות את השפע היחסי של משלוח RNAs קטן (מרין) הביע רקומביננטי adeno-וקטורים ויראליים הקשורים (rAAVs), כדי לזהות את הסף של ביטוי מרין כי יכול להיות נסבל לפני הכבד רעילות הקשורה בביטוי שרין עודף6. באמצעות פרוטוקול זה, זיהינו גם את מיקרו-מיקרונאס בכבד המגיבים להיעדר מיקרו-ארנה-122-מיקרומין הכבד מתבטאת במידה רבה, תוך שהיא גם מתכונת השפלה של מיקרוארנה7. מכיוון שאנחנו השתמשנו בפרוטוקול שלנו בעקביות בניסויים רבים, היינו מסוגלים להתבונן בlongitudinally ההכנות למדגם, ולראות שאין תופעות אצווה ניכרת.
בשיתוף פרוטוקול זה, המטרה שלנו היא לאפשר למשתמשים לייצר באיכות גבוהה, כימות הזדהות של Mic, כמעט כל רקמה או קו התא, באמצעות ציוד במחיר סביר, ריאגנטים, וכלים ביואינפורמטיקה חופשית.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות הזיהוי של מיקרורונאס לפני יותרמ-20שנה, תהליך הרצף של מיקרואורנה ממשיך להיות מפרך ודורש ציוד מיוחד, מעבדות הידרינג מאימוץ שגרתי של פרוטוקולים בבית14. טכניקות אחרות יכולות להעריך בו את microRNAs, כגון מיקרומערכים ולוחות ביטוי מרושני; עם זאת, גישות אלה מוגבלות בכך ש?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוני להודות לחברי המעבדות של אנדרו פייר ומארק קיי להדרכה והצעות.
Materials
| 100 bp DNA ladder | NEB | N3231 | |
| 19:1 bis-acrylamide | Millipore Sigma | A9926 | |
| 25 bp DNA step ladder | Promega | G4511 | |
| Acid phenol/chloroform | ThermoFisher | AM9720 | |
| Acrylamide RNA loading dye | ThermoFisher | R0641 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Biorad | 161-0700 | |
| Bioanalyzer instrument | Agilent | G2991AA | For assessing RNA quality and concentration |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Ethanol (100%) | Sigma | E7023 | |
| Gel Loading Buffer II | ThermoFisher | AM8547 | |
| GlycoBlue | ThermoFisher | AM9516 | Blue color helps in visualizing pellet |
| HCl | Sigma | 320331 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm | Genesee | 45-109 | |
| miRVana microRNA isolation kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| miSeq system | Illumina | SY-410-1003 | For generating small RNA sequencing data |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Nusieve low-melting agarose | Lonza | 50081 | |
| Parafilm (laboratory sealing film) | Millipore Sigma | P7793 | |
| Poly-ethylene glycol 8000 | NEB | included with M0204 | |
| ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit | NEB | E6560S | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit Fluorometer | ThermoFisher | Q33226 | For quantifying DNA concentration |
| Qubit RNA HS Assay kit | ThermoFisher | Q32855 | |
| Razor Blades | Fisher Scientific | 12640 | |
| Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | 02-681-331 | |
| T4 RNA ligase 1 | NEB | M0204 | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated | NEB | M0242S | |
| TapeStation | Agilent | G2939BA | For assessing RNA quality and concentration |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | |
| TEMED | Biorad | 161-0800 | |
| Tris Base pH 7.5 | Sigma | 10708976001 | |
| Tris-buffered EDTA | Sigma | T9285 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | |
| UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Universal miRNA cloning linker | NEB | S1315S | |
| Urea | Sigma | U5378 |
References
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
- Bartel, D. P. Metazoan MicroRNAs. Cell. 173 (1), 20-51 (2018).
- Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294 (5543), 858-862 (2001).
- Kim, V. N., Han, J., Siomi, M. C. Biogenesis of small RNAs in animals. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (2), 126-139 (2009).
- Gu, S., et al. The loop position of shRNAs and pre-miRNAs is critical for the accuracy of dicer processing in vivo. Cell. 151 (4), 900-911 (2012).
- Valdmanis, P. N., et al. RNA interference-induced hepatotoxicity results from loss of the first synthesized isoform of microRNA-122 in mice. Nature Medicine. 22 (5), 557-562 (2016).
- Valdmanis, P. N., et al. miR-122 removal in the liver activates imprinted microRNAs and enables more effective microRNA-mediated gene repression. Nature Communications. 9 (1), 5321 (2018).
- Griffiths-Jones, S. The microRNA Registry. Nucleic Acids Research. 32, D109-D111 (2004).
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34 (Database issue), D140-D144 (2006).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36 (Database issue), D154-D158 (2008).
- Patro, R., Mount, S. M., Kingsford, C. Sailfish enables alignment-free isoform quantification from RNA-seq reads using lightweight algorithms. Nature Biotechnology. 32 (5), 462-464 (2014).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Etheridge, A., Wang, K., Baxter, D., Galas, D. Preparation of Small RNA NGS Libraries from Biofluids. Methods in Molecular Biology. 1740, 163-175 (2018).
- Yamane, D., et al. Differential hepatitis C virus RNA target site selection and host factor activities of naturally occurring miR-122 3 variants. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4743-4755 (2017).
- Giraldez, M. D., et al. Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling. Nature Biotechnology. 36 (8), 746-757 (2018).
- Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19 (1), 118 (2018).
- Yeri, A., et al. Evaluation of commercially available small RNASeq library preparation kits using low input RNA. BMC Genomics. 19 (1), 331 (2018).
- Coenen-Stass, A. M. L., et al. Evaluation of methodologies for microRNA biomarker detection by next generation sequencing. RNA Biology. 15 (8), 1133-1145 (2018).
- Baran-Gale, J., et al. Addressing Bias in Small RNA Library Preparation for Sequencing: A New Protocol Recovers MicroRNAs that Evade Capture by Current Methods. Frontiers in Genetics. 6, 352 (2015).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39 (21), e141 (2011).
- Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6 (10), e26969 (2011).
- Valdmanis, P. N., et al. Upregulation of the microRNA cluster at the Dlk1-Dio3 locus in lung adenocarcinoma. Oncogene. 34 (1), 94-103 (2015).
- Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification. Clinical Chemistry. 61 (11), 1333-1342 (2015).
- Viollet, S., Fuchs, R. T., Munafo, D. B., Zhuang, F., Robb, G. B. T4 RNA ligase 2 truncated active site mutants: improved tools for RNA analysis. BMC Biotechnology. 11, 72 (2011).
- Chiang, H. R., et al. Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes. Genes & Development. 24 (10), 992-1009 (2010).
- Fromm, B., et al. A Uniform System for the Annotation of Vertebrate microRNA Genes and the Evolution of the Human microRNAome. Annual Review of Genetics. 49, 213-242 (2015).
