البكتيريا التي تحمل علامة الفلورسنت كجهاز تتبع للكشف عن مسارات جديدة لتدفق الكربون العضوي في النظم الإيكولوجية المائية
Summary
يُعرض هنا بروتوكول لتقنية أحادية الخلية، تقوم على الفحص المجهري لتحديد معدلات الرعي في اليوكاريوتس المفترسة المائية بدقة عالية ودقة تصنيفية.
Abstract
توضيح التفاعلات الغذائية، مثل predation وآثارها، هي مهمة متكررة لكثير من الباحثين في علم البيئة. دراسة المجتمعات الميكروبية لديها العديد من القيود، وتحديد الحيوانات المفترسة، فريسة، ومعدلات المفترسة غالبا ما يكون من الصعب. المعروضة هنا هي طريقة الأمثل على أساس إضافة فريسة وصفت الفلورسنت كتعقب، والذي يسمح لكمية موثوق بها من معدلات الرعي في eukaryotes المفترسة المائية وتقدير نقل المغذيات إلى مستويات أعلى من التغذية.
Introduction
prokaryotes Heterotrophic هي عنصر بيولوجي رئيسي في النظم المائية وتمثل جزءا كبيرا من الكتلة الحيوية العوالق1،2،3. العوامل التي تتحكم في وفرة، والتنوع، والنشاط هي حاسمة لفهم دورها في الدراجات البيوجيوكيميائية (أي مصير الكربون العضوي والمواد الغذائية الأخرى وتدفق الطاقة من prokaryotes إلى مستويات أعلى من التغذية). الرعي البروتوزوان هو واحد من هذه العوامل الهامة. البكتيريا من nanoflagellates غير متجانسة وأهداب يفرض سيطرة قوية من أعلى إلى أسفل على وفرة prokaryotic، وظيفة المجتمع، وهيكل، والتنوع، وحتى مورفولوجيا الخلوية ومعدل النمو من مجموعات بكتيرية معينة4، 5,6. في بعض النظم، وprotists بمثابة السبب الرئيسي للوفيات البكتيرية6،7.
النهج القياسي المستخدم لتقييم بكتيريا البروتوزوان، التي استخدمت لبعض الوقت الآن، ينطوي على استخدام البكتيريا التي تحمل اسم الفلورسنت (FLB) كنظائر فريسة والفحص المجهري. ويمكن تحديد معدلات الانتفاعي الخاصة بالخلايا من خلال تحديد عدد جزيئات الفرائس المسماة في فراغ الأغذية البروتستانية على مدى دورة زمنية مختارة8. وهناك عدة مزايا لهذا النهج. يتم إضافة التتبع إلى العينات الطبيعية مع الحيوانات المفترسة الطبيعية وتجمعات الفرائس. هناك الحد الأدنى من التلاعب عينة قبل الحضانة، والحد الأدنى من تغيير العينة من قبل التتبع FLB المضافة، وأوقات الحضانة قصيرة لضمان النتائج السليمة التي تم الحصول عليها في ظل ظروف قريبة في الموقع. وبدلاً من ذلك، في البيئات التي تنقصها أعداد المناوجيين أو العوالق الحيوانية (مثل النظم البحرية البحرية البحرية)، يمكن الكشف عن معدلات اختفاء FLB المضافة إلى العينات بكميات منخفضة (2٪ -3٪ التتبع) عن طريق قياس التدفق في المدى الطويل (12-24 ساعة) تجارب الحضانة. ثم، يتم قياس أرقام FLB في نقاط البداية والنهاية (دمج تأثير جميع البكتيريا) عن طريق قياس التدفق (للاطلاع على التفاصيل، انظر المنشور السابق9). ومع ذلك، فإن هذه المعلمة لا تمثل سوى مجموع معدلات البكتيريا المجمعة التي لا يمكن أن تعزى مباشرة إلى أي مجموعات أو أنواع معينة من البروتستان والعوالق الحيوانية.
وبشكل عام، فإن التحديد الكمي لمعدلات الوفيات البكتيرية الخاصة بالأنواع البروتستانية أو النمط المورفي في البيئة المائية بدقة وبمعنى إيكولوجي يمكن أن يكون أمراً صعباً. بعض الرعاة هم رعاة انتقائية، وحجم وشكل الخلية من المتتبع FLB المضافة قد تشوه المعدلات الطبيعية من ابتلاع فريسة10،11. وعلاوة على ذلك، نشاط بروتستان والتمثيل الغذائي هي درجة حرارة عالية حساسة12; لذلك، فإن كمية التتبع FLB المضافة تحتاج إلى التلاعب بعناية لكل نوع عينة الفردية (ليس فقط على أساس وفرة الطبيعية، وحجم، ومورفولوجيا البكتيريا والأنواع السائدة من البكتيريا، ولكن أيضا على درجة الحرارة). وتركز معظم الدراسات على نشاط الرعي البروتستان يُدفع بالجملة؛ ومع ذلك، فإن بكتيريا أنواع معينة من البروتستان غالبا ما يحمل قيمة معلومات أعلى بكثير، وقد يكون من الأفضل. في هذه الحالة، هناك حاجة إلى المعرفة التصنيفية للأنواع البروتيست الموجودة في عينة وفهم سلوكهم. وبالتالي، هناك حاجة إلى كميات كبيرة من الوقت والعمل للحصول على نتائج سليمة على معدلات الأنواع الخاصة من البكتيريا التي تعزى إلى مجموعة أو أنواع معينة من البروتستان.
وعلى الرغم من هذه الصعوبات، لا يزال هذا النهج الأداة الأنسب المتاحة حاليا لتقييم بكتيريا البروتستان في البيئات الطبيعية. تُعرض هنا طريقة شاملة وسهلة المتابعة لاستخدام FLB كمتتبع في دراسات الإيكولوجيا الميكروبية المائية. وتُحسب جميع الجوانب الإشكالية المذكورة في هذا النهج، ويرد وصف لسير العمل المحسن، مع تجربتين من بيئات متناقضة، فضلا عن الأنواع المتناقضة من الهداب كأمثلة على ذلك.
وقد أجريت دراسة الحالة الأولى في بيئة epilimnetic من خزان المياه الموريموففي في الجمهورية التشيكية، والتي تبين وفرة الرعي والبكتيرية مماثلة لمعظم المسطحات السطحية للمياه العذبة (انظر5و7). وقد أجريت دراسة الحالة الثانية في بيئة محددة للغاية داخل الفخاخ من النبات آكلة اللحوم المائية Utricularia reflexa، الذي يستضيف أعدادا عالية للغاية من كل من الهداب اتوافيك الرعي(Tetrahymena utriculariae) والخلايا البكتيرية. وتظهر حسابات معدلات الرعي الخاصة بالخلايا والمخزونات الدائمة البكتيرية في كلا النوعين من العينات. ثم تناقش مجموعة من التفسيرات الإيكولوجية للنتائج، ويقترح أخيرا أمثلة على دراسات المتابعة الممكنة.
Protocol
Representative Results
Discussion
فك التفاعل الغذائي في النظم المائية هو دائما تحديا28، وخاصة في جداول العوالق نانو التي تنطوي على protists وفريستهم ، والبكتيريا. عندما يتعلق الأمر بمسارات امتصاص المواد الغذائية والقياس الكمي، فإن تطبيق الأساليب المستخدمة بنجاح في مستويات غذائية أعلى أقل من الممكن، وذلك بسبب ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد حظيت هذه الدراسة بدعم المؤسسة التشيكية للعلوم في إطار منحة البحث 13-00243S و19-16554S الممنوحة لـ K. Š. وD.S.، على التوالي. كما تم دعم هذه المقالة من قبل مشروع “المعالجة البيولوجية كأداة لتحسين نوعية المياه من خزانات السدود” (لا CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_025/0007417)، بتمويل من الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية، في بحوث البرنامج التشغيلي، والتنمية والتعليم.
Materials
| 0.2-µm pore-size filters | SPI supplies, https://www.2spi.com/ | B0225-MB | Black, polycarbonate track etch membrane filters, diameter approprite for filtering apparatus used |
| 5-(4,6-dichlorotriazin-2-yl) aminofluorescein (DTAF) | Any brand | ||
| Automatic pipettes with adjustable volumes | Any brand, various sizes | ||
| Centrifuge | 22 000 x g | ||
| Cryovials | Any brand, 2 mL size | ||
| DAPI (4´,6-Diamidino-2´-phenylindole dihydrochloride) | Any brand | 1 mg ml-1 | |
| Epiflorescence microscope | Magnification from 400 x up to 1000 x | ||
| Filters appropriate for viewing in the DAPI and DTAF range | |||
| Counting grid in one of the oculars | |||
| Filtering apparatus | Usually with a diameter of 25 mm | ||
| Formaldehyde | A brand for microscopy | ||
| Glutaraldehyde | A brand for microscopy | ||
| Immersion oil for microscopy | Specific oil with low fluorescence | ||
| Lugol´s solution | Any brand or see comment | Make an alkaline Lugol' solution as follows: Solution 1 – dissolve 10 g of potassium iodide in 20 ml in MQ water, then add 5 g of iodine. Solution 2 – add 5 g of sodium acetate to 50 ml of MQ water. Add the solution 2 to the solution 1 and thoroughly mix | |
| Methanol stabilized formalin | Any brand available for microscopy purposes | ||
| Microscope slides and cover slips | Any brand produced for microscopy purposes | ||
| MQ water for diluting samples | Any brand |
||
| Phosphate-buffered saline (PBS; pH = 9) | Any brand | 0.05 M Na2HPO4-NaCl solution, adjusted to pH 9 | |
| PPi-saline buffer | Any brand | 0.02 M Na4P2O7-NaCl solution. Add 0.53 g Na4P2O7 to 100 ml of MQ water plus 0.85 g NaCl | |
| Sampling device | Appropriate for obtaining representative sample | e.g. Friedinger sampler for lake plankton | |
| Sodium thiosulfate solution | Any brand | 3% solution is used in the protocol | |
| Sonicator | Any brand | 30 W | |
| Vortex | Any brand allowing thorough mixing of the solutes and samples | ||
| Water bath | Any brand allowing temperature to be maintained at 60 °C |
References
- Azam, F., et al. The ecological role of water-column microbes in the sea. Marine Ecology Progress Series. 10, 257-263 (1983).
- Šimek, K., et al. A finely tuned symphony of factors modulates the microbial food web of a freshwater reservoir in spring. Limnology & Oceanography. 59, 1477-1492 (2014).
- Šimek, K., et al. Bacterial prey food characteristics modulate community growth response of freshwater bacterivorous flagellates. Limnology & Oceanography. 63, 484-502 (2018).
- Šimek, K., et al. Changes in bacterial community composition, dynamics and viral mortality rates associated with enhanced flagellate grazing in a meso-eutrophic reservoir. Applied & Environmental Microbiology. 67, 2723-2733 (2001).
- Jürgens, K., Matz, C. Predation as a shaping force for the phenotypic and genotypic composition of planktonic bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek. 81, 413-434 (2002).
- Pernthaler, J. Predation on prokaryotes in the water column and its ecological implications. Nature Reviews Microbiology. 3, 537-546 (2005).
- Berninger, U. B., Finlay, J., Kuuppo-Leinikki, P. Protozoan control of bacterial abundances in freshwaters. Limnology and Oceanography. 36, 139-147 (1991).
- Sherr, E. B., Sherr, B. F., Kemp, P. F., Sherr, B. F., Sherr, E. B., Cole, J. J. Protistan grazing rates via uptake of fluorescently labeled prey. Handbook of Methods in Aquatic Microbial Ecology. , 695-701 (1993).
- Vazquez-Dominguez, E., Peters, F., Gasol, J. M., Vaqué, D. Measuring the grazing losses of picoplankton: methodological improvements in the use of fluorescently tracers combined with flow cytometry. Aquatic Microbial Ecology. 20, 119-128 (1999).
- Šimek, K., et al. Ecological role and bacterial grazing of Halteria spp.: Small oligotrichs as dominant pelagic ciliate bacterivores. Aquatic Microbial Ecology. 22, 43-56 (2000).
- Montagnes, D. J. S., et al. Selective feeding behaviour of key free-living protists: avenues for continued study. Aquatic Microbial Ecology. 53, 83-98 (2008).
- Kirchman, D. L. . Processes in Microbial Ecology. 2nd Edition. , (2018).
- Porter, K. G., Feig, Y. S. The use of DAPI for identifying and counting aquatic microflora. Limnology and Oceanography. 25, 943-948 (1980).
- Foissner, W., Berger, H. A user-friendly guide to the ciliates (Protozoa, Ciliophora) commonly used by hydrobiologists as bioindicators in rivers, lakes, and waste waters, with notes on their ecology. Freshwater Biology. 35, 375-482 (1996).
- Foissner, W., Berger, H., Schaumburg, J. Identification and ecology of limnetic plankton ciliates. Informationsberichte des Bayer Landesamtes für Wasserwirtschaft Heft. , 3-99 (1999).
- Šimek, K., et al. Ciliate grazing on picoplankton in a eutrophic reservoir during the summer phytoplankton maximum: a study at the species and community level. Limnology & Oceanography. 40, 1077-1090 (1995).
- Skibbe, O. An improved quantitative protargol stain for ciliates and other planktonic protists. Archiv für. Hydrobiolgie. 130, 339-347 (1994).
- Macek, M., et al. Growth rates of dominant planktonic ciliates in two freshwater bodies of different trophic degree. Journal of Plankton Research. 18, 463-481 (1996).
- Šimek, K., et al. Microbial food webs in hypertrophic fishponds: omnivorous ciliate taxa are major protistan bacterivores. Limnology & Oceanography. , (2019).
- Jezbera, J., et al. Major freshwater bacterioplankton groups: Contrasting trends in distribution of Limnohabitans and Polynucleobacter lineages along a pH gradient of 72 habitats. FEMS Microbiology Ecology. 81, 467-479 (2012).
- Kasalický, V., et al. The diversity of the Limnohabitans genus, an important group of freshwater bacterioplankton, by characterization of 35 isolated strains. PLoS One. 8, 58209 (2013).
- Stabell, T. Ciliate bacterivory in epilimnetic waters. Aquatic Microbial Ecology. 10, 265-272 (1996).
- Zingel, P., et al. Ciliates are the dominant grazers on pico- and nanoplankton in a shallow, naturally highly eutrophic lake. Microbial Ecology. 53, 134-142 (2007).
- Bickel, S. L., Tang, K. W., Grossart, H. P. Ciliate epibionts associated with crustacean zooplankton in german lakes: distribution, motility, and bacterivory. Frontiers in Microbiology. 3 (243), (2012).
- Sirová, D., et al. Hunters or gardeners? Linking community structure and function of trap-associated microbes to the nutrient acquisition strategy of a carnivorous plant. Microbiome. 6, 225 (2018).
- Šimek, K., et al. Ecological traits of a zoochlorellae-bearing Tetrahymena sp. (Ciliophora) living in traps of the carnivorous aquatic plant Utricularia reflexa. Journal of Eukaryotic Microbiology. 64, 336-348 (2017).
- Pitsch, G., et al. The green Tetrahymena utriculariae n. sp. (Ciliophora, Oligohymenophorea) with its endosymbiotic algae (Micractinium sp.), living in the feeding traps of a carnivorous aquatic plant. Journal of Eukaryotic Microbiology. 64, 322-335 (2017).
- Nielsen, J. M., Clare, E. L., Hayden, B., Brett, M. T., Kratina, P. Diet tracing in ecology: Method comparison and selection. Methods in Ecology and Evaluation. 9, 278-291 (2018).
- Beisner, B. E., Grossart, H. P., Gasol, J. M. A guide to methods for estimating phago-mixotrophy in nanophytoplankton. Journal of Plankton Research. , 1-13 (2019).
- Dolan, J. D., Šimek, K. Processing of ingested matter in Strombidium sulcatum, a marine ciliate (Oligotrichida). Limnology and Oceanography. 42, 393-397 (1997).
- Massana, R., et al. Grazing rates and functional diversity of uncultured heterotrophic flagellates. The ISME Journal. 3, 588-596 (2009).
- Grujčić, V., et al. Cryptophyta as major freshwater bacterivores in experiments with manipulated bacterial prey. The ISME Journal. 12, 1668-1681 (2018).
