Bacterias etiquetadas fluorescentes como un rastreador para revelar nuevos caminos de flujo de carbono orgánico en ecosistemas acuáticos
Summary
Aquí se presenta un protocolo para una técnica monocelular basada en microscopía de epifluorescencia para cuantificar las tasas de pastoreo en eucariotas depredadores acuáticos con alta precisión y resolución taxonómica.
Abstract
La diluación de las interacciones tróficas, como la depredación y sus efectos, es una tarea frecuente para muchos investigadores en ecología. El estudio de las comunidades microbianas tiene muchas limitaciones, y determinar las tasas de depredadores, presas y depredadores a menudo es difícil. Aquí se presenta un método optimizado basado en la adición de presas etiquetadas fluorescentes como un trazador, que permite una cuantificación fiable de las tasas de pastoreo en eucariotas depredadores acuáticos y la estimación de la transferencia de nutrientes a niveles tróficos más altos.
Introduction
Los prokaryotes heterotróficos son un componente biológico clave en los sistemas acuáticos y representan una fracción significativa de la biomasa de plancton1,2,3. Los factores que controlan su abundancia, diversidad y actividad son cruciales para entender su papel en el ciclo biogeoquímico (es decir, el destino del carbono orgánico y otros nutrientes y el flujo de energía de los prokaryotes a niveles tróficos más altos). El pastoreo de protozoos es uno de estos factores importantes. Bacterivory de nanoflagelados y ciliados heterotróficos impone un fuerte control descendente sobre la abundancia procariótica, la función comunitaria, la estructura, la diversidad e incluso la morfología celular y la tasa de crecimiento de determinados grupos bacterianos4, 5,6. En algunos sistemas, los protistas sirven como la principal causa de mortalidad bacteriana6,7.
El enfoque estándar utilizado para evaluar el bacterivory protozoario, que se ha utilizado desde hace algún tiempo, implica el uso de bacterias etiquetadas fluorescentesmente (FLB) como análogos de presas y microscopía de epifluorescencia. Las tasas de captación específicas de células se pueden determinar cuantificando el número de partículas de presa etiquetadas en vacuolas de alimentos protistán durante un curso de tiempo seleccionado8. Este enfoque tiene varias ventajas. Tracer se añade a muestras naturales con conjuntos naturales de depredadores y presas. Hay una manipulación mínima de la muestra antes de la incubación, la alteración mínima de la muestra por el trazador FLB añadido, y los tiempos de incubación son cortos para asegurar que los resultados sonoros obtenidos en condiciones cercanas a in situ. Alternativamente, en entornos con un bajo número de protistas bacterívoros o zooplancton (por ejemplo, sistemas marinos en alta mar), las tasas de desaparición de FLB añadidas a las muestras en cantidades bajas (2%-3% trazador) se pueden detectar a través de citometría de flujo a largo plazo (12-24 h) experimentos de incubación. A continuación, los números de FLB en los puntos inicial y final (integrando el impacto de todos los bacterívoros) se cuantifican mediante citometría de flujo (para más detalles, véase la publicación anterior9). Sin embargo, este parámetro sólo representa tasas totales agregadas de bacterivory que no pueden atribuirse directamente a ningún grupo o especie de protistán y pasto de zooplancton en particular.
En general, cuantificar las tasas de mortalidad bacteriana específicas de las especies de protistán o morfotipos en el medio acuático con precisión y con significado ecológico puede ser difícil. Algunos protistas son pastores selectivos, y el tamaño y la forma celular del trazador FLB añadido pueden distorsionar las tasas naturales de ingestión de presas10,11. Además, la actividad y el metabolismo del protistán son altamente sensibles a la temperatura12; por lo tanto, la cantidad de trazador FLB añadido debe manipularse cuidadosamente para cada tipo de muestra individual (no sólo en función de la abundancia natural, el tamaño y la morfología de las bacterias y los tipos predominantes de bacterívoros, sino también de la temperatura). La mayoría de los estudios se centran en la actividad de pastoreo de protistano a granel; sin embargo, el bacterivory de especies específicas de protistán a menudo tiene un valor de información mucho más alto y puede ser preferible. En este caso, se necesita el conocimiento taxonómico de las especies protistas presentes en una muestra y comprensión de su comportamiento. Por lo tanto, se requieren cantidades considerables de tiempo y mano de obra para obtener resultados sólidos sobre las tasas específicas de bacterivo de especies atribuibles a un grupo o especie de protistán en particular.
A pesar de estas dificultades, este enfoque sigue siendo la herramienta más adecuada actualmente disponible para evaluar el bacterivory protistán en entornos naturales. Aquí se presenta un método completo y fácil de seguir para utilizar flb como marcador en estudios de ecología microbiana acuática. Se tienen en cuenta todos los aspectos problemáticos mencionados del enfoque y se describe un flujo de trabajo mejorado, con dos experimentos de entornos contrastantes, así como de especies ciliadas contrastantes como ejemplos.
El primer estudio de caso se llevó a cabo en un entorno epilimónico a partir del depósito de agua mesófico de la República Checa, que muestra abundancias de pastoreo y bacterias comparables a la mayoría de los cuerpos de agua dulce superficiales (cf.5,7). El segundo estudio de caso se llevó a cabo en el entorno altamente específico dentro de las trampas de la planta carnívora acuática Utricularia reflexa, que alberga un número extremadamente alto de ambos ciliados mixotricos de pastoreo (Tetrahymena utriculariae) y células bacterianas. Se muestran cálculos de las tasas de pastoreo específicas de las células y las existencias de pie bacteriana en ambos tipos de muestras. A continuación se discute una serie de interpretaciones ecológicas de los resultados, y finalmente se sugieren ejemplos de posibles estudios de seguimiento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descifrar la interacción trófica en los sistemas acuáticos siempre es un desafío28,especialmente a escalas de nanoplancton que involucran a los protistas y sus presas, bacterias. Cuando se trata de vías de acumulación de nutrientes y cuantificación, la aplicación de métodos utilizados con éxito en niveles tróficos más altos es menos posible, debido a la alta complejidad de las interacciones bióticas. Estos incluyen, por ejemplo, enfoques estables de etiquetado de isótopos. Este proto…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por la Fundación Checa de Ciencias bajo la beca de investigación 13-00243S y 19-16554S otorgada a K. . y D. S., respectivamente. Este artículo también fue apoyado por el proyecto “Biomanipulación como herramienta para mejorar la calidad del agua de los embalses de presas” (No CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_025/0007417), financiado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional, en El Programa Operativo de Investigación, Desarrollo y Educación.
Materials
| 0.2-µm pore-size filters | SPI supplies, https://www.2spi.com/ | B0225-MB | Black, polycarbonate track etch membrane filters, diameter approprite for filtering apparatus used |
| 5-(4,6-dichlorotriazin-2-yl) aminofluorescein (DTAF) | Any brand | ||
| Automatic pipettes with adjustable volumes | Any brand, various sizes | ||
| Centrifuge | 22 000 x g | ||
| Cryovials | Any brand, 2 mL size | ||
| DAPI (4´,6-Diamidino-2´-phenylindole dihydrochloride) | Any brand | 1 mg ml-1 | |
| Epiflorescence microscope | Magnification from 400 x up to 1000 x | ||
| Filters appropriate for viewing in the DAPI and DTAF range | |||
| Counting grid in one of the oculars | |||
| Filtering apparatus | Usually with a diameter of 25 mm | ||
| Formaldehyde | A brand for microscopy | ||
| Glutaraldehyde | A brand for microscopy | ||
| Immersion oil for microscopy | Specific oil with low fluorescence | ||
| Lugol´s solution | Any brand or see comment | Make an alkaline Lugol' solution as follows: Solution 1 – dissolve 10 g of potassium iodide in 20 ml in MQ water, then add 5 g of iodine. Solution 2 – add 5 g of sodium acetate to 50 ml of MQ water. Add the solution 2 to the solution 1 and thoroughly mix | |
| Methanol stabilized formalin | Any brand available for microscopy purposes | ||
| Microscope slides and cover slips | Any brand produced for microscopy purposes | ||
| MQ water for diluting samples | Any brand |
||
| Phosphate-buffered saline (PBS; pH = 9) | Any brand | 0.05 M Na2HPO4-NaCl solution, adjusted to pH 9 | |
| PPi-saline buffer | Any brand | 0.02 M Na4P2O7-NaCl solution. Add 0.53 g Na4P2O7 to 100 ml of MQ water plus 0.85 g NaCl | |
| Sampling device | Appropriate for obtaining representative sample | e.g. Friedinger sampler for lake plankton | |
| Sodium thiosulfate solution | Any brand | 3% solution is used in the protocol | |
| Sonicator | Any brand | 30 W | |
| Vortex | Any brand allowing thorough mixing of the solutes and samples | ||
| Water bath | Any brand allowing temperature to be maintained at 60 °C |
References
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