Un modello basato sulla linea cellulare Murine di inibizione cronica CDK9 per studiare i difetti di elongazione trascrizionale non genetica diffusa (TEsicuramente)in Tumori
Summary
Il protocollo descrive in dettaglio un modello carcinoma murino in vitro di allungamento della trascrizione non genetica difettosa. Qui, l’inibizione cronica del CDK9 viene utilizzata per reprimere l’allungamento produttivo dell’RNA Pol II lungo i geni pro-infiammatori di risposta per imitare e studiare il fenomeno clinicamente superato TEsicuramente, presente in circa il 20% di tutti i tipi di cancro.
Abstract
Abbiamo già riferito che un sottoinsieme di tumori è definito da deregulations trancrionali globali con carenze diffuse nell’allungamento della trascrizione dell’mRNA (TE), che chiamiamo tali tumori come TEsicuramente. In particolare, i tumori del TEsono caratterizzati da trascrizione spuria e elaborazione di mRNA difettosi in un ampio insieme di geni, come le vie interferone/JAK/STAT e TNF/NF-B, portando alla loro soppressione. Il TEsicuramente sottotipo di tumori nel carcinoma a cellule renali e pazienti con melanoma metastatico significativamente correlati con scarsa risposta ed esito in immunoterapia. Data l’importanza di studiareTE sicuramente i tumori – in quanto preannuncia un ostacolo significativo contro l’immunoterapia – l’obiettivo di questo protocollo è quello di stabilire un modello murino in vitroper studiare questi diffusi, non genetici anomalie trascrizionali nei tumori e ottenere nuove intuizioni, nuovi usi per i farmaci esistenti, o trovare nuove strategie contro tali tumori. Dettagliamo l’uso dell’inibizione cronica di CDK9 mediata dal flavopiridol per abrogare la fosfororylazione del residuo di serine 2 sul dominio di ripetizione del terminale C (CTD) della polimerasi RNA II (RNA PolI), sopprimendo il rilascio di RNA Pol II nella trascrizione produttiva Allungamento. Dato che TEsicuramente i tumori non sono classificati sotto una mutazione somatica specifica, un modello farmacologico è vantaggioso e imita al meglio i difetti trascrizionali ed epigenetici diffusi osservati in essi. L’uso di una dose sublethal ottimizzata di flavopiridol è l’unica strategia efficace nella creazione di un modello generalizzabile di interruzione non genetica diffusa nell’allungamento della trascrizione e nella lavorazione dell’mRNA, imitando da vicino il TE clinicamente osservato sicuramente caratteristiche. Pertanto, questo modello di TEpuò sicuramente essere sfruttato per sezionare fattori cellulari che consentono loro di resistere agli attacchi cellulari immuno-mediati.
Introduction
Un passo chiave di limitazione del tasso nell’espressione di quasi tutti i geni attivi è la transizione della polimerasi RNA II (RNA Pol II) dalla pausa promotore-prossidabile all’allungamento produttivo1,2. Dato che la disregolazione epigenetica dell’allungamento trascrizionale aiuta nella progressione di più malignità umane definite tesicuramente, portando a segnalazione non ottimale nelle vie di risposta pro-infiammatorie pari a una scarsa risposta e il risultato dell’immunoterapia3, l’obiettivo generale di questo protocollo è quello di stabilire un utile modello in vitro per studiare queste diffuse anomalie trascrizionali non genetiche nei tumori. In questa luce, l’uso di inibizione farmacologica cronica di CDK9 è una strategia efficace per la creazione di un modello generalizzabile di interruzione non genetica diffusa nell’allungamento della trascrizione e difetti di elaborazione dell’mRNA. La logica alla base dell’uso dell’inibizione cronica del CDK9 è che abroga la fosforillazione del residuo di serine 2 sul dominio di ripetizione del terminale C (CTD) di RNA Pol II, reprimendo così il rilascio di RNA Pol II nell’allungamento della trascrizione produttiva. Inoltre, i tumori TEsicuramente, descritti in precedenza dal nostro gruppo3, non sono classificati sotto alcuna specifica mutazione somatica. Pertanto, un modello non genetico (farmacologico) è vantaggioso e meglio imita i difetti trascrizionali ed epigenetici diffusi osservati in essi. Il metodo qui descrive la generazione e la caratterizzazione del modello di trattamento flavopiridol cronico delle cellule tumorali del murino. Questo metodo interrompe in modo dimostrabile l’allungamento della trascrizione lungo geni caratterizzati da lunghezze genomiche più lunghe, con promotori in bilico ed espressioni inducibili come TNF/NF-B e segnalazione di interferone/STAT, profondamente controllate a livello di trascrizione allungamento 3,4,5. Nel complesso, questo modello ottimizzato di linea cellulare murina di difetti di allungamento trascrizionale – l’unico modello a nostra conoscenza per studiare i tumoriTE definitivamente descritti di recente – guida la resistenza all’attacco immunitario anti-tumore, rendendo un sistema utile da sfruttare e esaminare le vulnerabilità dei difetti non genetici nei meccanismi di trascrizione dei principali nei tumori rispetto all’attacco cellulare immuno-mediato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il controllo dell’allungamento dell’RNA Pol II è emerso come una leva decisiva per regolare l’espressione genica reattiva allo stimolo a beneficio delle cellule maligne5,7,8. Superare la pausa promotore-proximal all’allungamento e la successiva produzione di mRNA richiede l’attività della chinasi di P-TEFb9,10,11. Il nostro modello ut…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato in parte supportato da NCI (CA193549) e CCHMC Research Innovation Pilot premi a Kakajan Komurov, e Department of Defense (BC150484) premio a Navneet Singh. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Cancer Institute o del Dipartimento della Difesa. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell’analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.
Materials
| hhis6FasL | Cell Signaling | 5452 | |
| 10X TBS | Bio-Rad | 170-6435 | |
| 12 well plates | Falcon | 353043 | |
| 20% methanol | Fisher Chemical | A412-4 | |
| 24-well plates | Falcon | 351147 | |
| 4–18% SDS polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561086 | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 5% dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
| 7-Methylguanosine antibody | BioVision | 6655-30T | |
| 96-well plates | Cellstar | 655180 | |
| AF647-conjugated mouse CD8 | Biolegend | 100727 | |
| antibiotic and antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| anti-His antibody | Cell Signaling | 2366 P | |
| Anti-Rabit | Cell Signaling | 7074 | Dilution 1:5000 |
| Anti-Rat | Cell Signaling | 7077S | Dilution 1:5000 |
| Bradford assay Kit | Bio-Rad | 5000121 | |
| BSA | ACROS Organics | 24040-0100 | |
| BV421-conjugated mouse CD45 | Biolegend | 109831 | |
| crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| Dynabeads Oligo (dT)25 | Ambion | 61002 | |
| FBS | Gibco | 45015 | |
| Fixable Live/Dead staining dye e780 | eBioscience | 65-0865-14 | |
| Flavopiridol | Selleckchem | S1230 | |
| H3k36me3 | Abcam | ab9050 | Dilution 1:2000 |
| IFN-α | R&D systems | 12100-1 | |
| IFN-γ | R&D systems | 485-MI-100 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | |
| NF-κB | Cell Signaling | 8242s | Dilution 1:1000 |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| p-NF-κB | Cell Signaling | 3033s | Dilution 1:1000 |
| p-Ser2-RNAPII | Active Motif | 61083 | Dilution 1:500 |
| p-Ser5-RNAPII | Active Motif | 61085 | Dilution 1:1000 |
| p-STAT1 | Cell Signaling | 7649s | Dilution 1:1000 |
| RiboMinu Eukaryote Kit | Ambion | A10837-08 | |
| RIPA buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | |
| RNAPII | Active Motif | 61667 | Dilution 1:1000 |
| STAT1 | Cell Signaling | 9175s | Dilution 1:1000 |
| TNF-α | R&D systems | 410-MT-010 | |
| total H3 | Cell Signaling | 4499 | Dilution 1:2000 |
| Tri reagent | Sigma | T9424 | |
| Triton | Sigma | T8787-50ML | |
| Tween 20 | AA Hoefer | 9005-64-5 | |
| β-Actin | Cell Signaling | 12620S | Dilution 1:5000 |
| β-ME | G Biosciences | BC98 |
References
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