癌における広範な非遺伝的転写伸長欠損(TE)を研究する慢性CDK9阻害のマウス細胞株ベースモデル
Summary
このプロトコルは、非遺伝的欠陥転写伸びのインビトロマウス癌モデルを詳述する。ここで、CDK9の慢性阻害は、全癌型の約20%に存在する臨床的に過剰なTE間違いなく現象を模倣し、研究するために、炎症反応遺伝子に沿ったRNA Pol IIの生産的な伸びを抑制するために使用される。
Abstract
我々は以前に、癌のサブセットは、mRNA転写伸長(TE)の広範な欠陥を伴う世界的な転写規制緩和によって定義されていると報告しました- 我々は間違いなくTEとしてそのような癌を呼び出します。特に、TE間違いなく癌は、インターフェロン/JAK/STATおよびTNF/NF-B経路などの大きな遺伝子群における偽の転写および欠陥のあるmRNA処理によって特徴付けられ、その抑制につながる。腎細胞癌および転移性黒色腫患者における腫瘍のTEは間違いなく免疫療法における不十分な応答および結果と相関する。TEの間違いなく癌を調査することの重要性を考えると、免疫療法に対する重大な障害を引き起こすので、このプロトコルの目的は、これらの広範な非遺伝的研究を研究するために、インビトロTE間違いなくマウスモデルを確立することです。癌の転写異常と新しい洞察を得る, 既存の薬剤のための新しい用途, またはそのような癌に対する新しい戦略を見つける.RNAポリメラーゼII(RNA Pol II)のC末端反復ドメイン(CTD)上のセリン2残基のリン酸化を損分化する慢性フラボピリドール媒介CDK9阻害の使用を詳述し、RNA Pol IIの放出を生産的な転写に抑制する。伸長。TEは間違いなく特定の体細胞変異に分類されていないことを考えると、薬理学的モデルは有利であり、それらに観察される広範な転写およびエピジェネティックな欠陥を最もよく模倣する。フラボピリドールの最適化された亜致死量の使用は、転写伸長およびmRNA処理欠陥における非遺伝的広範な破壊の一般化可能なモデルを作成する唯一の有効な戦略であり、臨床的に観察されたTEを密接に模倣する間違いなく特性。したがって、TEのこのモデルは間違いなく、免疫媒介細胞攻撃に抵抗するそれらを可能にする、細胞自律的な因子を解剖するために利用することができる。
Introduction
ほぼすべての活性遺伝子の発現における重要な速度制限ステップは、プロモーター近位休止から生産的な伸び1、2へのRNAポリメラーゼII(RNA Pol II)の遷移である。転写伸びのエピジェネティックな調節がTEと定義された複数のヒト悪性腫瘍の進行を確実に助長することを考えると、反応不良に相当する炎症性反応経路における最適でないシグナル伝達を引き起こす免疫療法3への結果は、このプロトコルの包括的な目標は、癌におけるこれらの広範な非遺伝的転写異常を研究するために有用なインビトロモデルを確立することです。この点において、CDK9の慢性薬理学的阻害の使用は、転写伸長およびmRNA処理欠陥における非遺伝的広範な破壊の全身化可能なモデルを作成するための有効な戦略である。慢性CDK9阻害を用いた根拠は、RNA Pol IIのC末端反復ドメイン(CTD)上のセリン2残基のリン酸化を緩和し、したがって、生産的な転写伸びへのRNA Pol IIの放出を抑制する。また、TEは、我々のグループ3によって前述した、間違いなく癌は、任意の特定の体細胞変異下に分類されない。したがって、非遺伝的(薬理学的)モデルは有利であり、それらに観察される広範な転写およびエピジェネティックな欠陥を最もよく模倣する。本明細行の方法は、マウス癌細胞の慢性フラボピリドール治療モデルの生成および特徴付けについて詳述する。この方法は、TNF/NF-κBおよびインターフェロン/STATシグナル伝達のような、より長いゲノム長さによって特徴付けられた遺伝子に沿った転写伸長を実証的に破壊し、そのレベルで深く制御される。転写伸長3,4,5.全体的に、転写伸び欠陥のこの最適化されたマウス細胞ラインモデルは、新たに記述されたTE間違いなく腫瘍を研究する我々の知識に対する唯一のモデルであり、抗腫瘍免疫攻撃に対する耐性を駆動し、悪用する有用なシステムをレンダリングし、がんにおけるコア転写機械における非遺伝的欠陥の脆弱性を調べる。
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA Pol II伸長制御は、悪性細胞5、7、8の利益に対する刺激応答性遺伝子発現を調節するための決定的なレバーとして出現した。伸びに対するプロモーター近位休止を克服し、その後のmRNA産生は、P-TEFb9、10、11のキナーゼ活性を必要とする。我々のモデル?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NCI(CA193549)とCCHMCリサーチイノベーションパイロット賞のカカジャン・コムロフ賞、国防総省(BC150484)がナヴニー・シンに授与されました。内容は著者の責任のみであり、必ずしも国立がん研究所または国防総省の公式見解を表すものではありません。資金提供者は、研究の設計、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備に何の役割も持ちはありませんでした。
Materials
| hhis6FasL | Cell Signaling | 5452 | |
| 10X TBS | Bio-Rad | 170-6435 | |
| 12 well plates | Falcon | 353043 | |
| 20% methanol | Fisher Chemical | A412-4 | |
| 24-well plates | Falcon | 351147 | |
| 4–18% SDS polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561086 | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 5% dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
| 7-Methylguanosine antibody | BioVision | 6655-30T | |
| 96-well plates | Cellstar | 655180 | |
| AF647-conjugated mouse CD8 | Biolegend | 100727 | |
| antibiotic and antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| anti-His antibody | Cell Signaling | 2366 P | |
| Anti-Rabit | Cell Signaling | 7074 | Dilution 1:5000 |
| Anti-Rat | Cell Signaling | 7077S | Dilution 1:5000 |
| Bradford assay Kit | Bio-Rad | 5000121 | |
| BSA | ACROS Organics | 24040-0100 | |
| BV421-conjugated mouse CD45 | Biolegend | 109831 | |
| crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| Dynabeads Oligo (dT)25 | Ambion | 61002 | |
| FBS | Gibco | 45015 | |
| Fixable Live/Dead staining dye e780 | eBioscience | 65-0865-14 | |
| Flavopiridol | Selleckchem | S1230 | |
| H3k36me3 | Abcam | ab9050 | Dilution 1:2000 |
| IFN-α | R&D systems | 12100-1 | |
| IFN-γ | R&D systems | 485-MI-100 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | |
| NF-κB | Cell Signaling | 8242s | Dilution 1:1000 |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| p-NF-κB | Cell Signaling | 3033s | Dilution 1:1000 |
| p-Ser2-RNAPII | Active Motif | 61083 | Dilution 1:500 |
| p-Ser5-RNAPII | Active Motif | 61085 | Dilution 1:1000 |
| p-STAT1 | Cell Signaling | 7649s | Dilution 1:1000 |
| RiboMinu Eukaryote Kit | Ambion | A10837-08 | |
| RIPA buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | |
| RNAPII | Active Motif | 61667 | Dilution 1:1000 |
| STAT1 | Cell Signaling | 9175s | Dilution 1:1000 |
| TNF-α | R&D systems | 410-MT-010 | |
| total H3 | Cell Signaling | 4499 | Dilution 1:2000 |
| Tri reagent | Sigma | T9424 | |
| Triton | Sigma | T8787-50ML | |
| Tween 20 | AA Hoefer | 9005-64-5 | |
| β-Actin | Cell Signaling | 12620S | Dilution 1:5000 |
| β-ME | G Biosciences | BC98 |
References
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