Identifikation af fodspor af RNA: protein komplekser via RNA Immunopræcipitation i tandem efterfulgt af sekventering (RIPiT-SEQ)
Summary
Her præsenterer vi en protokol for at berige endogene RNA-bindingssteder eller “fodspor” af RNA: protein (RNP)-komplekser fra pattedyrsceller. Denne fremgangsmåde involverer to immunoprecipitationer af RNP under enheder og er derfor døbt RNA chromatinimmunpræcipitation i tandem (ripit).
Abstract
RNA chromatinimmunpræcipitation i tandem (ripit) er en metode til at berige RNA fodspor af et par proteiner i et RNA: protein (RNP) kompleks. RIPiT anvender to rensningstrin. For det første er immunopræcipitation af en Tagged RNP-underenhed efterfulgt af mild RNase fordøjelse og efterfølgende ikke-Denaturerings affinitet eluering. En anden chromatinimmunpræcipitation af en anden RNP-underenhed giver mulighed for tilsætning af et defineret kompleks. Efter en denaturering af RNAs og proteiner omdannes RNA-fodaftryk til DNA-sekvensering biblioteker med høj gennemløb. I modsætning til de mere populære ultraviolet (UV) binding efterfulgt af chromatinimmunpræcipitation (Clip) tilgang til at berige RBP bindingssteder, ripit er UV-binding uafhængig. Derfor kan RIPiT anvendes til talrige proteiner til stede i RNA interactome og ud over, der er afgørende for RNA-regulering, men ikke direkte kontakte RNA eller UV-crosslink dårligt til RNA. De to rensningstrin i RIPiT giver en yderligere fordel ved at identificere bindingssteder, hvor et protein af interesse optræder i partnerskab med en anden cofactor. Den dobbelte rensningsstrategi tjener også til at forbedre signalet ved at begrænse baggrunden. Her giver vi en trinvis procedure til at udføre RIPiT og generere High-gennemløb sekvensering biblioteker fra isolerede RNA fodspor. Vi skitserer også RIPiT fordele og applikationer og diskutere nogle af sine begrænsninger.
Introduction
I cellerne findes RNA i kompleks med proteiner til dannelse af RNA: protein komplekser (Rnp’er). Rnp’er samles omkring RNA-bindende proteiner (RBPs, dem, der binder RNA direkte), men omfatter også ikke-RBPs (dem, der binder RBPs, men ikke RNA), og er ofte dynamiske i naturen. Rbps og deres cofaktorer fungerer kollektivt inden for rnp’er for at udføre reguleringsfunktioner. For eksempel genkender UPF-proteinerne (UPF1, UPF2 og UPF3b) i den nonsens-medierede mRNA Decay-pathway (NMD) de tidligt afsluttede ribosome. Hver af UPF-proteinerne kan binde sig til RNA, men det er kun, når de samler, at et aktivt NMD-kompleks begynder at danne. Inden for dette kompleks, UPF1 er yderligere aktiveret ved fosforylering af en ikke-RBP SMG1, og en sådan UPF1 aktivering i sidste ende fører til ansættelse af mRNA forfald inducerende faktorer1,2. I dette eksempel kræver RBPs ikke-RBP-cofaktorer til rekruttering og aktivering af RNP-komplekset, der udløser NMD. Endnu en ejendom af Rnp’er er deres kompositoriske heterogenitet. Overvej spliceosome, som findes i særskilte E, A, B eller C komplekser. Forskellige spliceosome komplekser har overlappende og forskellige proteiner3. For at studere RNP funktioner, er det vigtigt at belyse, hvilke RNAs er bundet af en RBP og dens associerede proteiner. Mange metoder findes for at opnå dette, med hver tilgang har sine særskilte fordele og ulemper4,5,6,7.
De meget populære metoder til at identificere RBP bindingssteder-binding efterfulgt af chromatinimmunpræcipitation (Clip) og dens forskellige variationer-stole på ultraviolet (UV) lys til at link en RBP til RNA8. Dette er imidlertid ikke en effektiv fremgangsmåde for ikke-RBPs inden for Rnp’er, som ikke direkte kontakter RNA. Her beskriver vi en alternativ tilgang, der gælder for både RBPs og ikke-RBPs, for at isolere og identificere deres RNA-bindingssteder. Denne fremgangsmåde betegnes RNA immunopræcipitation i tandem (ripit) består af to chromatinimmunpræcipitation trin, som hjælper med at opnå højere specificitet i forhold til en enkelt rensning (figur 1)9,10. Da de enkelte immunopræcipitation (IP) trin kan udføres ved en lavere strenghed i forhold til klip, er ripit ikke afhængig af tilgængeligheden af antistoffer, der kan modstå tilstedeværelsen af stærke rengøringsmidler under chromatinimmunpræcipitation. Den mest unikke fordel ved RIPiT er evnen til at målrette to forskellige proteiner i to rensningstrin; Dette giver en effektiv måde at berige en kompositionelt distinkt RNP kompleks fra andre lignende komplekser11.
Små variationer i RIPiT proceduren kan yderligere forbedre RNP berigelse. For eksempel er nogle RNA-protein eller protein-protein interaktioner inden for Rnp’er forbigående, og det kan være vanskeligt effektivt at rense fodspor af sådanne komplekser. For at stabilisere sådanne interaktioner kan rnp’er være tværbundet i celler med formaldehyd før cellelyse og ripit. For eksempel har vi observeret, at en svag interaktion mellem exon Junction Complex (EJC) Core Factor, EIF4AIII og EJC demontering faktor, PYM12 kan stabiliseres med formaldehyd behandling, således at flere RNA fodspor er beriget (data ikke vist). Før celle høst og RIPiT kan cellerne også behandles med lægemidler for at stabilisere eller berige Rnp’er i en bestemt tilstand. For eksempel, når man studerer proteiner, der fjernes fra mRNA under oversættelsen (f. eks. EJC UPF114), kan behandling med oversættelses hæmmere såsom puromycin, cycloheximide eller harringtonin føre til øget belægning af proteiner på RNAs.
Mængden af RNA genvundet fra RIPiT er normalt lav (0.5-10 pmoles, dvs 10-250 ng RNA overvejer en gennemsnitlig RNA længde på 75 NT). Den primære årsag til dette er, at kun en lille brøkdel af et givet protein er til stede i kompleks med andre proteiner inden for RNPs (enhver “gratis” protein IP’ed i første trin er tabt i løbet af den anden IP). For at generere RNA-SEQ biblioteker fra denne RNA, vi også skitsere her en tilpasning af tidligere offentliggjorte protokol egnet til sådanne lav RNA indgange15,16 (figur 2), som giver høj gennemløb sekvensering klar prøver i 3 Dage.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi diskuterer her nogle vigtige overvejelser for at kunne udføre RIPiT. De enkelte IP’er skal først og fremmest optimeres for at opnå størst mulig effektivitet ved hvert trin. Mængden af FLAG agopstået perler for input antallet af celler, der er beskrevet her, har vist sig at være robust for en bred vifte af proteiner, vi har testet. Da kun en lille brøkdel af partner proteiner er co-immunoprecipiteret med FLAG proteinet, er den mængde antistof, der er nødvendig for effektiv anden IP, sædvanligvis lav (mindre …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NIH Grant GM120209 (GS). Forfatterne takker OSUCCC Genomics delte ressourcer kerne for deres tjenester (CCC støtte Grant NIC P30 CA16058).
Materials
| Anti-FLAG Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| ATP, [γ-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml EasyTide, 250µCi | PerkinElmer | BLU502A250UC | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (200) | Fisher | 14-823-435 | |
| Betaine 5M | Sigma | B0300 | |
| biotin-dATP | TriLink | N-5002 | |
| biotin-dCTP | Perkin Elmer | NEL540001EA | |
| Branson Sonifier, Model SSE-1 | Branson | ||
| CircLigase I | VWR | 76081-606 | ssDNA ligase I |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11995-065 | |
| DNA load buffer NEB | NEB | ||
| Dynabeads Protein A | LifeTech | 10002D | |
| Flp-In-T-REx 293 Cell Line | ThermoFisher | R78007 | |
| GeneRuler Low Range DNA Ladder | ThermoScientific | FERSM1203 | |
| Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | |
| Mini-PROTEAN TBE Gel 10 well | Bio-Rad | 4565013 | |
| Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel | Bio-Rad | 4566033 | |
| miRCAT-33 adapter 5′-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3′ | Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| Mirus transIT-X2 transfection reagent | Mirus | MIR 6004 | |
| Mth RNA ligase | NEB | E2610S | |
| PE1.0 5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| PE2.0 5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTC GGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC*T-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1, pH 6.7, 100ml) | Fisher | BP1752I-100 | |
| Purple Gel Loading Dye (6x) | NEB | NEB #7025 | |
| Q5 DNA Polymerase | NEB | M0491S/L | |
| RNase I, E. coli, 1000 units | Eppicenter | N6901K | |
| SPIN-X column | Corning | CLS8160-24EA | |
| Streptavidin beads | ThermoFisher | 60210 | |
| Superscript III (SSIII) | ThermoScientific | 18080044 | reverse transcriptase enzyme |
| SybrGold | ThermoFisher | S11494 | gold nucleic acid gel stain |
| T4 Polynucleotide Kinase-2500U | NEB | M0201L | |
| T4RNL2 Tr. K227Q | NEB | M0351S | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | |
| Thermostable 5´ App DNA/RNA Ligase | NEB | M0319S | |
| TruSeq_SE1 5′-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE10 5′-pGGTGTTCNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE11 5′-pGGTAAGTNNNNNAGATCGGAA GAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE12 5′-pGGAGATGNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE2 5′-pGGGTAGCNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE35′-pGGTCGATNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE4 5′-pGGCCTCGNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE5 5′-pGGTGACANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE6 5′-pGGTAGACNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE7 5′-pGGGCCCTNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCT TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE8 5′-pGGATCGGNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTT CCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE9 5′-pGGACTGANNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| Typhoon 5 Bimolecular Imager | GE Healthcare Life Science | 29187191 |
References
- Karousis, E. D., Nasif, S., Mühlemann, O. Nonsense-mediated mRNA decay: novel mechanistic insights and biological impact. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 7 (5), 661-682 (2016).
- Ivanov, P. V., Gehring, N. H., Kunz, J. B., Hentze, M. W., Kulozik, A. E. Interactions between UPF1, eRFs, PABP and the exon junction complex suggest an integrated model for mammalian NMD pathways. The EMBO Journal. 27 (5), 736-747 (2008).
- Papasaikas, P., Valcárcel, J. The Spliceosome: The Ultimate RNA Chaperone and Sculptor. Trends in Biochemical Sciences. 41 (1), 33-45 (2016).
- Jensen, K. B., Darnell, R. B. CLIP: Crosslinking and ImmunoPrecipitation of In Vivo RNA Targets of RNA-Binding Proteins. Methods in Molecular Biology. 488, 85-98 (2008).
- Garzia, A., Morozov, P., Sajek, M., Meyer, C., Tuschl, T. PAR-CLIP for Discovering Target Sites of RNA-Binding Proteins. mRNA Decay: Methods and Protocols. 1720, 55-75 (2018).
- Konig, J., et al. iCLIP – Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).
- Sibley, C. R. Individual Nucleotide Resolution UV Cross-Linking and Immunoprecipitation (iCLIP) to Determine Protein-RNA Interactions. RNA Detection: Methods and Protocols. 1649, 427-454 (2018).
- Wheeler, E. C., Van Nostrand, E. L., Yeo, G. W. Advances and challenges in the detection of transcriptome‐wide protein-RNA interactions. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (1), (2018).
- Singh, G., et al. The Cellular EJC Interactome Reveals Higher-Order mRNP Structure and an EJC-SR Protein Nexus. Cell. 151, 750-764 (2012).
- Singh, G., Ricci, E. P., Moore, M. J. RIPiT-Seq: A high-throughput approach for footprinting RNA:protein complexes. Methods. 65, 320-332 (2014).
- Mabin, J. W., et al. The Exon Junction Complex Undergoes a Compositional Switch that Alters mRNP Structure and Nonsense-Mediated mRNA Decay Activity. Cell Reports. 25 (9), 2431-2446 (2018).
- Gehring, N. H., Lamprinaki, S., Kulozik, A. E., Hentze, M. W. Disassembly of Exon Junction Complexes by PYM. Cell. 137 (3), 536-548 (2009).
- Dostie, J., Dreyfuss, G. Translation Is Required to Remove Y14 from mRNAs in the Cytoplasm. Current Biology. 12 (13), 1060-1067 (2002).
- Zünd, D., Gruber, A. R., Zavolan, M., Mühlemann, O. Translation-dependent displacement of UPF1 from coding sequences causes its enrichment in 3′ UTRs. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (8), 936-943 (2013).
- Gangras, P., Dayeh, D. M., Mabin, J. W., Nakanishi, K., Singh, G. Cloning and Identification of Recombinant Argonaute-Bound Small RNAs Using Next-Generation Sequencing. Argonaute Proteins: Methods and Protocols. 1680, 1-28 (2018).
- Heyer, E. E., Ozadam, H., Ricci, E. P., Cenik, C., Moore, M. J. An optimized kit-free method for making strand-specific deep sequencing libraries from RNA fragments. Nucleic Acids Research. 43 (1), 2 (2015).
- Cameron, V., Uhlenbeck, O. C. 3′-Phosphatase activity in T4 polynucleotide kinase. 생화학. 16 (23), 5120-5126 (1977).
- Ricci, E. P., et al. Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).
- Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nature Communications. 6, 10237 (2015).
- Metkar, M., et al. Higher-Order Organization Principles of Pre-translational mRNPs. Molecular Cell. 72 (4), 715-726 (2018).
- Giudice, G., Sánchez-Cabo, F., Torroja, C., Lara-Pezzi, E. ATtRACT-a database of RNA-binding proteins and associated motifs. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).
- Paz, I., Kosti, I., Ares, M., Cline, M., Mandel-Gutfreund, Y. RBPmap: a web server for mapping binding sites of RNA-binding proteins. Nucleic Acids Research. 42, 361-367 (2014).
- Sundararaman, B., et al. Resources for the Comprehensive Discovery of Functional RNA Elements. Molecular Cell. 61 (6), 903-913 (2016).
