Identificação de pegadas de RNA: complexos proteicos via imunoprecipitação de RNA em tandem seguido de sequenciamento (RIPiT-Seq)
Summary
Aqui, nós apresentamos um protocolo para enriquecer locais de ligação do RNA endógeno ou “pegadas” de complexos do RNA: proteína (RNP) das pilhas de mamífero. Essa abordagem envolve duas imunoprecipitações de subunidades de RNP e, portanto, é apelidado de imunoprecipitação de RNA em tandem (RIPiT).
Abstract
A imunoprecipitação do RNA em tandem (RIPiT) é um método para enriquecer pegadas do RNA de um par de proteínas dentro de um complexo do RNA: proteína (RNP). O RIPiT emprega duas etapas de purificação. Primeiramente, a imunoprecipitação de um subunidade etiquetado de RNP é seguida pela digestão suave de RNase e pela eluição não-desnaturando subseqüente da afinidade. Uma segunda imunoprecipitação de outra subunidade da RNP permite o enriquecimento de um complexo definido. Depois de uma eluição de desnaturação de RNAs e proteínas, as pegadas de RNA são convertidas em bibliotecas de sequenciamento de DNA de alta produtividade. Ao contrário do mais popular ultravioleta (UV) reticulação seguido por imunoprecipitação (clip) abordagem para enriquecer RBP sites de ligação, RipIt é UV-reticulação independente. Daqui o ripit pode ser aplicado às proteínas numerosas atuais no de do RNA e além de que são essenciais à regulação do RNA mas não contatam diretamente o RNA ou o UV-Crosslink mal ao RNA. As duas etapas da purificação em RIPiT fornecem uma vantagem adicional de identificar os locais obrigatórios onde uma proteína do interesse actua na parceria com um outro cofactor. A dupla estratégia de purificação também serve para melhorar o sinal, limitando o fundo. Aqui, fornecemos um procedimento passo-sábio para executar o RIPiT e para gerar bibliotecas de sequenciamento de alto débito de pegadas de RNA isoladas. Também esboçamos as vantagens e aplicações do RIPiT e discutimos algumas das suas limitações.
Introduction
Dentro das células, o RNA existe no complexo com proteínas para formar os complexos RNA: protein (RNPs). RNPs são montados em torno das proteínas de ligação do RNA (RBPs, aqueles que ligam diretamente o RNA) mas igualmente compreendem de non-RBPs (aqueles que ligam RBPs mas não o RNA), e são frequentemente dinâmicos na natureza. Rbps e seus cofatores funcionam coletivamente dentro de rnps para executar funções regulatórias. Por exemplo, na via de deterioração de mRNA mediada por disparates (NMD), as proteínas UPF (UPF1, UPF2 e UPF3b) reconhecem o Ribossome prematuramente finalizado. Cada uma das proteínas de UPF pode ligar ao RNA, mas é somente quando montam junto que um complexo ativo de NMD começa a se formar. Dentro deste complexo, UPF1 é ativado mais pela fosforilação por um SMG1 não-RBP, e essa ativação UPF1 eventualmente leva ao recrutamento de fatores Indutores de decaimento de mRNA1,2. Neste exemplo, o RBPs requer cofatores não RBP para recrutamento e ativação do complexo RNP que aciona a NMD. No entanto, outra propriedade de RNPs é a sua heterogeneidade composicional. Considere o spliceosome, que existe em distintos complexos de E, A, B ou C. Os complexos spliceossoma diferentes têm as proteínas de sobreposição e distintas3. Para estudar as funções da RNP, é importante elucidar quais RNAs são vinculados por uma RBP e suas proteínas associadas. Existem muitos métodos para fazer isso, com cada abordagem tendo suas distintas vantagens e desvantagens4,5,6,7.
Os métodos amplamente populares para identificar sítios de ligação da RBP — reticulação seguida de imunoprecipitação (CLIP) e suas várias variações-dependem da luz ultravioleta (UV) para vincular uma RBP ao RNA8. Entretanto, esta não é uma aproximação eficaz para non-RBPs dentro de RNPs, que não contatam o RNA diretamente. Aqui, nós descrevemos uma aproximação alternativa que seja aplicável aos RBPs e não-RBPs igualmente, para isolar e identificar seus locais da ligação do RNA. Essa abordagem denominada imunoprecipitação de RNA em tandem (ripit) consiste em duas etapas de imunoprecipitação, que auxiliam na obtenção de maior especificidade em relação a uma única purificação (Figura 1)9,10. Como as etapas individuais da imunoprecipitação (IP) podem ser executadas em uma mais baixa rigor em comparação ao grampo, o ripit não depende da disponibilidade dos anticorpos que podem suportar a presença de detergentes fortes durante a imunoprecipitação. A vantagem a mais original de RIPiT é a habilidade de alvejar duas proteínas diferentes em duas etapas da purificação; Isto fornece uma maneira poderosa de enriquecer um complexo composicionalmente distinto de RNP de outros complexos similares11.
Pequenas variações no procedimento do RIPiT podem aumentar ainda mais o enriquecimento de RNP. Por exemplo, algumas interações RNA-proteína ou proteína-proteína dentro de RNPs são transitórios e pode ser difícil purificar eficientemente pegadas de tais complexos. Para estabilizar essas interações, os RNPs podem ser reticulados dentro de células com formaldeído antes da lise celular e do RIPiT. Por exemplo, nós observamos que uma interação fraca entre o fator de núcleo complexo da junção do exon (EJC), EIF4AIII e o fator da desmontagem de EJC, PYM12 pode ser estabilizado com o tratamento do formaldehyde tal que mais pegadas do RNA são enriquecidas (dados não mostrado). Antes da colheita da pilha e do RIPiT, as pilhas podem igualmente ser tratadas com as drogas para estabilizar ou enriquecer RNPs em um estado particular. Por exemplo, ao estudar proteínas que são removidas do mRNA durante a tradução (por exemplo, a EJC UPF114), o tratamento com inibidores de tradução como a puromicina, cicloheximida ou harringtonina pode levar ao aumento da ocupação de proteínas em RNAs.
A quantidade de RNA recuperado de RIPiT é geralmente baixa (0.5-10 pmoles, isto é, 10-250 ng RNA considerando um comprimento médio do RNA de 75 NT). A principal razão para isso é que apenas uma pequena fração de uma determinada proteína está presente no complexo com outras proteínas dentro de RNPs (qualquer “livre” proteína IP’ed na primeira etapa é perdida durante o segundo IP). Para gerar bibliotecas de RNA-Seq deste RNA, nós igualmente esboçamos aqui uma adaptação do protocolo previamente publicado apropriado para tais baixas entradas do RNA15,16 (Figura 2), que rende amostras prontas de sequenciamento de alta produtividade em 3 Dias.
Protocol
Representative Results
Discussion
Discutimos aqui algumas considerações-chave para executar com sucesso o RIPiT. Acima de tudo, IPs individuais devem ser otimizados para alcançar a maior eficiência possível em cada etapa. A quantidade de grânulos do agarose da bandeira para o número de entrada das pilhas descreveu aqui provou ser robusta para uma vasta gama de proteínas que nós testamos. Como apenas uma pequena fração das proteínas parceiras é coimunoprecipitada com a proteína FLAG, a quantidade de anticorpos necessários para o segundo IP …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela concessão GM120209 de NIH (GS). Os autores agradecem o núcleo de recursos compartilhados da OSUCCC Genomics para seus serviços (CCC support Grant NCI p30 CA16058).
Materials
| Anti-FLAG Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| ATP, [γ-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml EasyTide, 250µCi | PerkinElmer | BLU502A250UC | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (200) | Fisher | 14-823-435 | |
| Betaine 5M | Sigma | B0300 | |
| biotin-dATP | TriLink | N-5002 | |
| biotin-dCTP | Perkin Elmer | NEL540001EA | |
| Branson Sonifier, Model SSE-1 | Branson | ||
| CircLigase I | VWR | 76081-606 | ssDNA ligase I |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11995-065 | |
| DNA load buffer NEB | NEB | ||
| Dynabeads Protein A | LifeTech | 10002D | |
| Flp-In-T-REx 293 Cell Line | ThermoFisher | R78007 | |
| GeneRuler Low Range DNA Ladder | ThermoScientific | FERSM1203 | |
| Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | |
| Mini-PROTEAN TBE Gel 10 well | Bio-Rad | 4565013 | |
| Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel | Bio-Rad | 4566033 | |
| miRCAT-33 adapter 5′-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3′ | Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| Mirus transIT-X2 transfection reagent | Mirus | MIR 6004 | |
| Mth RNA ligase | NEB | E2610S | |
| PE1.0 5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| PE2.0 5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTC GGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC*T-3′ |
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| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1, pH 6.7, 100ml) | Fisher | BP1752I-100 | |
| Purple Gel Loading Dye (6x) | NEB | NEB #7025 | |
| Q5 DNA Polymerase | NEB | M0491S/L | |
| RNase I, E. coli, 1000 units | Eppicenter | N6901K | |
| SPIN-X column | Corning | CLS8160-24EA | |
| Streptavidin beads | ThermoFisher | 60210 | |
| Superscript III (SSIII) | ThermoScientific | 18080044 | reverse transcriptase enzyme |
| SybrGold | ThermoFisher | S11494 | gold nucleic acid gel stain |
| T4 Polynucleotide Kinase-2500U | NEB | M0201L | |
| T4RNL2 Tr. K227Q | NEB | M0351S | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | |
| Thermostable 5´ App DNA/RNA Ligase | NEB | M0319S | |
| TruSeq_SE1 5′-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE10 5′-pGGTGTTCNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE11 5′-pGGTAAGTNNNNNAGATCGGAA GAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE12 5′-pGGAGATGNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE2 5′-pGGGTAGCNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE35′-pGGTCGATNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE4 5′-pGGCCTCGNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE5 5′-pGGTGACANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE6 5′-pGGTAGACNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE7 5′-pGGGCCCTNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCT TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE8 5′-pGGATCGGNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTT CCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE9 5′-pGGACTGANNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| Typhoon 5 Bimolecular Imager | GE Healthcare Life Science | 29187191 |
References
- Karousis, E. D., Nasif, S., Mühlemann, O. Nonsense-mediated mRNA decay: novel mechanistic insights and biological impact. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 7 (5), 661-682 (2016).
- Ivanov, P. V., Gehring, N. H., Kunz, J. B., Hentze, M. W., Kulozik, A. E. Interactions between UPF1, eRFs, PABP and the exon junction complex suggest an integrated model for mammalian NMD pathways. The EMBO Journal. 27 (5), 736-747 (2008).
- Papasaikas, P., Valcárcel, J. The Spliceosome: The Ultimate RNA Chaperone and Sculptor. Trends in Biochemical Sciences. 41 (1), 33-45 (2016).
- Jensen, K. B., Darnell, R. B. CLIP: Crosslinking and ImmunoPrecipitation of In Vivo RNA Targets of RNA-Binding Proteins. Methods in Molecular Biology. 488, 85-98 (2008).
- Garzia, A., Morozov, P., Sajek, M., Meyer, C., Tuschl, T. PAR-CLIP for Discovering Target Sites of RNA-Binding Proteins. mRNA Decay: Methods and Protocols. 1720, 55-75 (2018).
- Konig, J., et al. iCLIP – Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).
- Sibley, C. R. Individual Nucleotide Resolution UV Cross-Linking and Immunoprecipitation (iCLIP) to Determine Protein-RNA Interactions. RNA Detection: Methods and Protocols. 1649, 427-454 (2018).
- Wheeler, E. C., Van Nostrand, E. L., Yeo, G. W. Advances and challenges in the detection of transcriptome‐wide protein-RNA interactions. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (1), (2018).
- Singh, G., et al. The Cellular EJC Interactome Reveals Higher-Order mRNP Structure and an EJC-SR Protein Nexus. Cell. 151, 750-764 (2012).
- Singh, G., Ricci, E. P., Moore, M. J. RIPiT-Seq: A high-throughput approach for footprinting RNA:protein complexes. Methods. 65, 320-332 (2014).
- Mabin, J. W., et al. The Exon Junction Complex Undergoes a Compositional Switch that Alters mRNP Structure and Nonsense-Mediated mRNA Decay Activity. Cell Reports. 25 (9), 2431-2446 (2018).
- Gehring, N. H., Lamprinaki, S., Kulozik, A. E., Hentze, M. W. Disassembly of Exon Junction Complexes by PYM. Cell. 137 (3), 536-548 (2009).
- Dostie, J., Dreyfuss, G. Translation Is Required to Remove Y14 from mRNAs in the Cytoplasm. Current Biology. 12 (13), 1060-1067 (2002).
- Zünd, D., Gruber, A. R., Zavolan, M., Mühlemann, O. Translation-dependent displacement of UPF1 from coding sequences causes its enrichment in 3′ UTRs. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (8), 936-943 (2013).
- Gangras, P., Dayeh, D. M., Mabin, J. W., Nakanishi, K., Singh, G. Cloning and Identification of Recombinant Argonaute-Bound Small RNAs Using Next-Generation Sequencing. Argonaute Proteins: Methods and Protocols. 1680, 1-28 (2018).
- Heyer, E. E., Ozadam, H., Ricci, E. P., Cenik, C., Moore, M. J. An optimized kit-free method for making strand-specific deep sequencing libraries from RNA fragments. Nucleic Acids Research. 43 (1), 2 (2015).
- Cameron, V., Uhlenbeck, O. C. 3′-Phosphatase activity in T4 polynucleotide kinase. 생화학. 16 (23), 5120-5126 (1977).
- Ricci, E. P., et al. Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).
- Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nature Communications. 6, 10237 (2015).
- Metkar, M., et al. Higher-Order Organization Principles of Pre-translational mRNPs. Molecular Cell. 72 (4), 715-726 (2018).
- Giudice, G., Sánchez-Cabo, F., Torroja, C., Lara-Pezzi, E. ATtRACT-a database of RNA-binding proteins and associated motifs. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).
- Paz, I., Kosti, I., Ares, M., Cline, M., Mandel-Gutfreund, Y. RBPmap: a web server for mapping binding sites of RNA-binding proteins. Nucleic Acids Research. 42, 361-367 (2014).
- Sundararaman, B., et al. Resources for the Comprehensive Discovery of Functional RNA Elements. Molecular Cell. 61 (6), 903-913 (2016).
