Идентификация следов РНК:Белковые комплексы через РНК иммунопреципиция в Тандеме После секвенирования (RIPiT-Seq)
Summary
Здесь мы представляем протокол для обогащения эндогенных связывающих участков РНК или “следов” комплексов РНК:белка (РНП) из клеток млекопитающих. Этот подход включает в себя два иммунопреципиции субъединиц РНП и поэтому называют РНК иммунопрецитацией в тандеме (RIPiT).
Abstract
Рнкова иммунопрецит в тандеме (RIPiT) является методом для обогащения РНК следы пары белков в комплексе РНК:белок (RNP). RIPiT использует два этапа очистки. Во-первых, иммунопрециция помеченного субединицы RNP сопровождается мягким пищеварением RNase и последующим неденативным сродством elution. Второе иммунопрецициционное опора другого подразделения РНП позволяет обогащать определенный комплекс. После денатурации elution РНК и белков, РНК следы преобразуются в высокой пропускной способности ДНК секвенирования библиотек. В отличие от более популярных ультрафиолетовых (УФ) перекрестных ссылок с последующим иммунопрецистирующим (CLIP) подходом к обогащению связывающих мест RBP, RIPiT является независимым от УЛЬТРА-кроссулинки. Следовательно RIPiT можно приложить к многочисленнLp протеинам присытствыющим в interactome RNA и за пределами которые необходимы к регулировке RNA но сразу не контактируют RNA или UV-crosslink плох к RNA. Два шага очистки в RIPiT обеспечивают дополнительное преимущество определения связывающих участков, где белок, представляющий интерес действует в партнерстве с другим кофактором. Стратегия двойной очистки также служит для повышения сигнала путем ограничения фона. Здесь мы предоставляем пошаговую процедуру для выполнения RIPiT и создания библиотек с высокой пропускной способностью из изолированных следов РНК. Мы также излагаем преимущества и приложения RIPiT и обсуждаем некоторые из его ограничений.
Introduction
Внутри клеток РНК существует в комплексе с белками для формирования РНК:белковых комплексов (РНК). RNPs собраны вокруг белков связывания РНК (RBPs, те, которые непосредственно связывают РНК), но также состоят из не-RBPs (те, которые связывают RBPs, но не РНК), и часто динамические по своему характеру. РРП и их кофакторы коллективно функционируют в рамках РСП для выполнения регулятивных функций. Например, в пути распада мРНК (NMD) upF белки UPF (UPF1, UPF2 и UPF3b) распознают преждевременно прекращенную рибосому. Каждый из белков UPF может связываться с РНК, но только тогда, когда они собираются вместе, что активный комплекс NMD начинает формироваться. В рамках этого комплекса, UPF1 дополнительно активируется фосфорилированием не-RBP SMG1, и такая активация UPF1 в конечном итоге приводит к набору мРНК распада индуцирующих факторов1,2. В этом примере РБП требуют кофакторов, не относясь от RBP, для набора и активации комплекса RNP, который запускает НМД. Еще одним свойством РНП является их композиционная неоднородность. Рассмотрим сплайсесом, который существует в различных комплексах E, A, B или C. Различные сплайсцеосомные комплексыимеют перекрывающиеся и различные белки 3. Для изучения функций RNP важно выяснить, какие РНК связаны RBP и связанными с ним белками. Многие методы существуют для достижения этой цели, скаждым подходом, имеющим свои отличительные преимущества и недостатки 4,5,6,7.
Широко популярные методы для определения RBP связывающих сайтов – перекрестные с последующими иммунопрецицией (CLIP) и его различные вариации – полагаться на ультрафиолетовый (УФ) свет для перекрестного RBP к РНК8. Тем не менее, это не является эффективным подходом для не-RBPs в рамках RNPs, которые не связываются с РНК напрямую. Здесь мы описываем альтернативный подход, применимый как к RBP, так и к не-RBPs, чтобы изолировать и идентифицировать их сайты связывания РНК. Этот подход называется РНК иммунопрецитификации в тандеме (RIPiT) состоит из двух иммунопреципции шаги, которые помогают достичь более высокой специфичности по сравнению с одной очистки (Рисунок 1)9,10. Поскольку индивидуальные иммунопретенции (Ip) шаги могут быть выполнены на более низкой строгости по сравнению с CLIP, RIPiT не зависит от наличия антител, которые могут выдержать наличие сильных моющих средств во время иммунопреципиции. Самым уникальным преимуществом RIPiT является способность нацеливают два разных белка на два этапа очистки; это обеспечивает мощный способ обогатить композиционно различные RNP комплекса из других подобных комплексов11.
Небольшие изменения в процедуре RIPiT могут способствовать дальнейшему обогащению РНП. Например, некоторые взаимодействия РНК-белка или белка в РНП являются временными, и может быть трудно эффективно очищать следы таких комплексов. Для стабилизации таких взаимодействий, RNPs могут быть перекрестными внутри клеток с формальдегидом до лизиса клетки и RIPiT. Например, мы заметили, что слабое взаимодействие между основным фактором экзон-соединения (EJC) (EJC) и фактором разборки EJC, PYM12 может быть стабилизировано с помощью обработки формальдегида таким образом, что больше следов РНК обогащается (данные не показано). До сбора клеток и RIPiT, клетки также могут быть обработаны препаратами для стабилизации или обогащения RNPs в определенном состоянии. Например, при изучении белков, которые удаляются из мРНК во время перевода (например, EJC13,UPF114),лечение ингибиторами перевода, такими как пуромицин, циклогексимид или харрингтонин, может привести к увеличению заполняемости белки на РНК.
Количество РНК, извлеченных из RIPiT, как правило, является низким (0,5-10 pmoles, т.е. 10-250 нг РНК с учетом средней длины РНК 75 nt). Основная причина этого заключается в том, что лишь малая часть данного белка присутствует в комплексе с другими белками в РНП (любой “свободный” белок IP’ed на первом этапе теряется во время второго IP). Для создания библиотек RNA-Seq из этой РНК, мы также наметить здесь адаптацию ранее опубликованного протокола подходит для таких низких входов РНК15,16 (Рисунок2), который дает высокой пропускной способности секвенирования готовых образцов в 3 Дней.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы обсуждаем здесь некоторые ключевые соображения для успешного выполнения RIPiT. Прежде всего, отдельные ИП должны быть оптимизированы для достижения максимально возможной эффективности на каждом этапе. Количество бусинок FLAG agarose для входиного количества клеток, описанных здесь, оказа…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом NIH GM120209 (GS). Авторы благодарят OSUCCC Genomics Genomics Shared Resources Core за их услуги (CCC Support Grant NCI P30 CA16058).
Materials
| Anti-FLAG Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| ATP, [γ-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml EasyTide, 250µCi | PerkinElmer | BLU502A250UC | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (200) | Fisher | 14-823-435 | |
| Betaine 5M | Sigma | B0300 | |
| biotin-dATP | TriLink | N-5002 | |
| biotin-dCTP | Perkin Elmer | NEL540001EA | |
| Branson Sonifier, Model SSE-1 | Branson | ||
| CircLigase I | VWR | 76081-606 | ssDNA ligase I |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11995-065 | |
| DNA load buffer NEB | NEB | ||
| Dynabeads Protein A | LifeTech | 10002D | |
| Flp-In-T-REx 293 Cell Line | ThermoFisher | R78007 | |
| GeneRuler Low Range DNA Ladder | ThermoScientific | FERSM1203 | |
| Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | |
| Mini-PROTEAN TBE Gel 10 well | Bio-Rad | 4565013 | |
| Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel | Bio-Rad | 4566033 | |
| miRCAT-33 adapter 5′-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3′ | Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| Mirus transIT-X2 transfection reagent | Mirus | MIR 6004 | |
| Mth RNA ligase | NEB | E2610S | |
| PE1.0 5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| PE2.0 5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTC GGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC*T-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1, pH 6.7, 100ml) | Fisher | BP1752I-100 | |
| Purple Gel Loading Dye (6x) | NEB | NEB #7025 | |
| Q5 DNA Polymerase | NEB | M0491S/L | |
| RNase I, E. coli, 1000 units | Eppicenter | N6901K | |
| SPIN-X column | Corning | CLS8160-24EA | |
| Streptavidin beads | ThermoFisher | 60210 | |
| Superscript III (SSIII) | ThermoScientific | 18080044 | reverse transcriptase enzyme |
| SybrGold | ThermoFisher | S11494 | gold nucleic acid gel stain |
| T4 Polynucleotide Kinase-2500U | NEB | M0201L | |
| T4RNL2 Tr. K227Q | NEB | M0351S | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | |
| Thermostable 5´ App DNA/RNA Ligase | NEB | M0319S | |
| TruSeq_SE1 5′-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE10 5′-pGGTGTTCNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE11 5′-pGGTAAGTNNNNNAGATCGGAA GAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE12 5′-pGGAGATGNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE2 5′-pGGGTAGCNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE35′-pGGTCGATNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE4 5′-pGGCCTCGNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE5 5′-pGGTGACANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE6 5′-pGGTAGACNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE7 5′-pGGGCCCTNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCT TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE8 5′-pGGATCGGNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTT CCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE9 5′-pGGACTGANNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| Typhoon 5 Bimolecular Imager | GE Healthcare Life Science | 29187191 |
References
- Karousis, E. D., Nasif, S., Mühlemann, O. Nonsense-mediated mRNA decay: novel mechanistic insights and biological impact. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 7 (5), 661-682 (2016).
- Ivanov, P. V., Gehring, N. H., Kunz, J. B., Hentze, M. W., Kulozik, A. E. Interactions between UPF1, eRFs, PABP and the exon junction complex suggest an integrated model for mammalian NMD pathways. The EMBO Journal. 27 (5), 736-747 (2008).
- Papasaikas, P., Valcárcel, J. The Spliceosome: The Ultimate RNA Chaperone and Sculptor. Trends in Biochemical Sciences. 41 (1), 33-45 (2016).
- Jensen, K. B., Darnell, R. B. CLIP: Crosslinking and ImmunoPrecipitation of In Vivo RNA Targets of RNA-Binding Proteins. Methods in Molecular Biology. 488, 85-98 (2008).
- Garzia, A., Morozov, P., Sajek, M., Meyer, C., Tuschl, T. PAR-CLIP for Discovering Target Sites of RNA-Binding Proteins. mRNA Decay: Methods and Protocols. 1720, 55-75 (2018).
- Konig, J., et al. iCLIP – Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).
- Sibley, C. R. Individual Nucleotide Resolution UV Cross-Linking and Immunoprecipitation (iCLIP) to Determine Protein-RNA Interactions. RNA Detection: Methods and Protocols. 1649, 427-454 (2018).
- Wheeler, E. C., Van Nostrand, E. L., Yeo, G. W. Advances and challenges in the detection of transcriptome‐wide protein-RNA interactions. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (1), (2018).
- Singh, G., et al. The Cellular EJC Interactome Reveals Higher-Order mRNP Structure and an EJC-SR Protein Nexus. Cell. 151, 750-764 (2012).
- Singh, G., Ricci, E. P., Moore, M. J. RIPiT-Seq: A high-throughput approach for footprinting RNA:protein complexes. Methods. 65, 320-332 (2014).
- Mabin, J. W., et al. The Exon Junction Complex Undergoes a Compositional Switch that Alters mRNP Structure and Nonsense-Mediated mRNA Decay Activity. Cell Reports. 25 (9), 2431-2446 (2018).
- Gehring, N. H., Lamprinaki, S., Kulozik, A. E., Hentze, M. W. Disassembly of Exon Junction Complexes by PYM. Cell. 137 (3), 536-548 (2009).
- Dostie, J., Dreyfuss, G. Translation Is Required to Remove Y14 from mRNAs in the Cytoplasm. Current Biology. 12 (13), 1060-1067 (2002).
- Zünd, D., Gruber, A. R., Zavolan, M., Mühlemann, O. Translation-dependent displacement of UPF1 from coding sequences causes its enrichment in 3′ UTRs. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (8), 936-943 (2013).
- Gangras, P., Dayeh, D. M., Mabin, J. W., Nakanishi, K., Singh, G. Cloning and Identification of Recombinant Argonaute-Bound Small RNAs Using Next-Generation Sequencing. Argonaute Proteins: Methods and Protocols. 1680, 1-28 (2018).
- Heyer, E. E., Ozadam, H., Ricci, E. P., Cenik, C., Moore, M. J. An optimized kit-free method for making strand-specific deep sequencing libraries from RNA fragments. Nucleic Acids Research. 43 (1), 2 (2015).
- Cameron, V., Uhlenbeck, O. C. 3′-Phosphatase activity in T4 polynucleotide kinase. 생화학. 16 (23), 5120-5126 (1977).
- Ricci, E. P., et al. Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).
- Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nature Communications. 6, 10237 (2015).
- Metkar, M., et al. Higher-Order Organization Principles of Pre-translational mRNPs. Molecular Cell. 72 (4), 715-726 (2018).
- Giudice, G., Sánchez-Cabo, F., Torroja, C., Lara-Pezzi, E. ATtRACT-a database of RNA-binding proteins and associated motifs. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).
- Paz, I., Kosti, I., Ares, M., Cline, M., Mandel-Gutfreund, Y. RBPmap: a web server for mapping binding sites of RNA-binding proteins. Nucleic Acids Research. 42, 361-367 (2014).
- Sundararaman, B., et al. Resources for the Comprehensive Discovery of Functional RNA Elements. Molecular Cell. 61 (6), 903-913 (2016).
