Visualizando dinâmica sadrindo de receptor estéta de células t usando microscopia de folha de luz de rede
Summary
O objetivo deste protocolo é mostrar como usar microscopia de folha de luz de rede para visualizar quatro dimensões a dinâmica do receptor de superfície em células vivas. Aqui são mostrados receptores de células T em células CD4+ T primárias.
Abstract
A sinalização e a função de uma célula são ditadas pelas estruturas dinâmicas e interações de seus receptores de superfície. Para realmente entender a relação estrutura-função desses receptores in situ, precisamos visualizá-los e rastreá-los na superfície das células vivas com resolução suficiente spatiotemporal. Aqui mostramos como usar microscopia de folha de luz de rede recém-desenvolvida (LLSM) para imagem de receptores de células T (TCRs) quatro dimensionalmente (4D, espaço e tempo) na membrana celular ao vivo. As células T são uma das principais células effectoras do sistema imunológico adaptativo, e aqui usamos as células T como exemplo para mostrar que a sinalização e a função dessas células são impulsionadas pela dinâmica e interações dos TCRs. O LLSM permite imagens 4D com resolução sem precedentes. Esta técnica de microscopia, portanto, pode ser geralmente aplicada a uma ampla gama de moléculas superficiais ou intracelulares de diferentes células na biologia.
Introduction
A dinâmica precisa do tráfico de moléculas e difusão na superfície celular tridimensional em tempo real têm sido um enigma para resolver. A microscopia sempre foi um equilíbrio de velocidade, sensibilidade e resolução; se qualquer um ou dois forem maximizados, o terceiro é minimizado. Portanto, devido ao pequeno tamanho e imensa velocidade com que os receptores de superfície se movem, o rastreamento de sua dinâmica tem permanecido um grande desafio tecnológico para o campo da biologia celular. Por exemplo, muitos estudos têm sido realizados utilizando a microscopia total de fluorescência interna (TIRF)1,2,3, que tem alta resolução temporal, mas só pode imaginar uma fatia muito fina da membrana t-cell (~100 nm), e, portanto, perde eventos acontecendo mais longe na célula. Essas imagens tirf também mostram apenas uma seção bidimensional da célula. Em contrapartida, técnicas de superresolução, como microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM)4,microscopia de localização fotoativada (PALM)5e microscopia de esgotamento de emissões estimuladas (STED)6, podem superar o limite de difração de luz abbe. Essas técnicas têm alta resolução espacial (~20 nm resolução)4,5,6,7,mas muitas vezes levam muitos minutos para adquirir uma imagem bidimensional completa (2D) ou tridimensional (3D) e, portanto, a resolução temporal é perdida. Além disso, técnicas como STORM e PALM que dependem de sinais piscando podem ter imprecisões na contagemde 8,9. A microscopia eletrônica tem de longe a mais alta resolução (até 50 pm resolução)10; ele pode até ser conduzido tridimensionalmente com microscopia eletrônica de varredura de feixe de íon focada (FIB-SEM), resultando em até 3 nm XY e resolução de 500 nm Z11. No entanto, qualquer forma de microscopia eletrônica requer preparação de amostra gemida severa e só pode ser conduzida com células ou tecidos fixos, eliminando a possibilidade de imagens de amostras vivas ao longo do tempo.
Técnicas para obter a alta resolução spatiotemporal necessária para identificar a dinâmica das moléculas superficiais e intracelulares em células vivas em sua verdadeira natureza 3D fisiológica só estão sendo desenvolvidas recentemente. Uma dessas técnicas é a Microscopia de Folha de Luz de Retta (LLSM)12,que utiliza uma folha de luz estruturada para diminuir drasticamente o fotobranqueamento. Desenvolvido em 2014 pelo ganhador do Nobel Eric Betzig, a alta resolução axial, o baixo fotobranqueamento e o ruído de fundo, e a capacidade de imagem simultânea de centenas de aviões por campo de visão tornam microscópios LLS superiores aos microscópios widefield, TIRF e confocals12,13,14,15,16,17,18,19. Esta técnica de imagem de quatro dimensões (x, y, z e tempo), embora ainda limitada (resolução XYZ de ~200 nm), tem uma incrível resolução temporal (alcançamos uma taxa de quadros de cerca de 100 fps, resultando em uma imagem celular reconstruída em 3D com 0,85 segundos por quadro) para aquisição espacial 3D.
LlSM pode ser geralmente usado para rastrear dinâmicas em tempo real de quaisquer moléculas dentro de qualquer célula no nível de única molécula e unicelular, particularmente aquelas em células altamente mois, como células imunes. Por exemplo, mostramos aqui como usar llsm para visualizar a dinâmica do receptor de células T (TCR). As células T são as células effector do sistema imunológico adaptativo. Os TCRs são responsáveis pelo reconhecimento de ligantes peptídeos-MHC (pMHC) exibidos na superfície das células presentes a antígenos (APC), que determina a seleção, desenvolvimento, diferenciação, destino e função de uma célula T. Esse reconhecimento ocorre na interface entre células T e APCs, resultando em agrupamento de receptores localizados para formar o que é chamado de sinapse imunológica. Embora se saiba que os TCRs na sinapse imunológica são imperativos para a função de efeito t-células, ainda desconhecidos são os mecanismos subjacentes do tráfico de TCR em tempo real para a sinapse. A LLSM nos permitiu visualizar em tempo real a dinâmica dos TCRs antes e depois do tráfico para a sinapse com a interação pMHC-TCR resultante (Figura 1). O LLSM pode, portanto, ser usado para resolver questões atuais da dinâmica formativa dos TCRs e fornecer insights para entender como uma célula distingue entre antígenos eu e estrangeiros.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo apresentado foi otimizado para o uso de células CD4+ T isoladas de 5C. Camundongos transgênicos C7 no instrumento LLSM usados e, portanto, outros sistemas celulares e LLSMs podem precisar ser otimizados de forma diferente. No entanto, este protocolo mostra o poder da imagem 4D, pois pode ser usado para quantificar a dinâmica de um receptor de superfície em uma célula inteira com a menor distorção em condições fisiológicas. Portanto, existem muitas aplicações futuras possíveis desta té…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de reconhecer o conselho e a orientação do Dr. Vytas Bindokas na Universidade de Chicago. Agradecemos ao Centro Integrado de Microscopia Leve da Universidade de Chicago por apoiar e manter o microscópio de folha de luz de rede. Este trabalho foi apoiado pelo NIH New Innovator Award 1DP2AI144245 e pelo NSF Career Award 1653782 (To J.H.). J.R. é apoiado pelo Programa de Bolsas de Pesquisa de Pós-Graduação da NSF.
Materials
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | For T cell harvest |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | For T cell culture |
| 5 mm round coverslips | World Precision Instruments | 502040 | For Imaging |
| 70um Sterile Cell Strainer | Corning | 7201431 | For T cell harvest |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR β chain Antibody | BioLegend | 109215 | For Imaging |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | X&Y Cell Culture | FBS-500 | For T cell culture |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | Denisty gradient reagent for T cell harvest |
| Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | For microscope alignment |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres | Thermo Fisher Scientific | F8810 | For microscope alignment |
| Imaris | Bitplane | N/A | Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji). |
| Lattice Light-Sheet Microscope | 3i | N/A | Microscope Used |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 21083027 | For Imaging |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | For T cell culture |
| LLSpy | Janelia Research Campus | N/A | LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/ |
| Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK | Elimbio | Custom Synthesis | For T cell harvest |
| Penacillin/Streptamycin | Life Technologies | 15140122_3683884612 | For T cell culture |
| Poly-L-Lysine | Phenix Research Products | P8920-100ML | For Imaging |
| RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4300-54 | For T cell harvest |
| Recombinant mouse IL-2 | Sigma-Aldrich | I0523 | For T cell culture |
| RPMI 1640 Medium | Corning | MT10040CV | For T cell culture |
| Slidebook | 3i | N/A | LLSM imaging software |
| Surgical Dissection Tools | Nova-Tech International | DSET10 | For T cell harvest |
| T-25 Flasks | Eppendorf | 2231710126 | For T cell culture |
| Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits | Thermo Fisher Scientific | 44685 | For preparing Fab |
References
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