우리는 epifluorescence 현미경을 사용하여 애기장대 이중 수정에 있는 정액 핵 형태에 근거하여 성공또는 실패한 수정을 결정하는 방법을 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
꽃 피는 식물은 '이중 수정'이라는 독특한 성적 재생 시스템을 가지고, 있는 정자 세포의 각각은 정확하게 계란 세포 또는 중앙 세포와 융합. 따라서, 2개의 독립적인 풍부하게 함 사건은 거의 동시에 일어든다. 수정란 세포와 중앙 세포는 각각 접합체와 배유로 발전합니다. 따라서, 이중 풍부하게 함의 정밀한 통제는 계속되는 종자 발달을 위해 필수적이다. 이중 수정은 깊게 숨겨져 두꺼운 난소 와 난소 조직으로 덮여 여성 gametophyte (배아 낭)에서 발생합니다. 이 암술 조직 건설은 이중 수정의 관측 그리고 분석을 아주 어렵게 하고 이중 풍부하게 함의 기계장치에 관하여 많은 질문이 대답되지 않는 남아 있는 현재 상황을 만들었습니다. 수정 조절제에 대한 잠재적 인 후보의 기능적 평가를 위해, 풍부하게 함의 의 자형 분석이 중요하다. 애기장대에서수정의 완료를 판단하기 위해, 정자 핵을 표시하는 형광 신호의 모양은 지표로 사용됩니다. 수정하지 못하는 정자 세포는 여성 gametes 외부의 응축형 신호에 의해 표시되는 반면, 성공적으로 비옥하게 하는 정자 세포는 여성 gametes의 핵을 가진 karyogamy 때문에 decondensed 신호에 의해 표시됩니다. 여기서 설명된 방법은 생체 내 조건하에서 성공 또는 실패한 수정을 결정하는 도구를 제공한다.
서론
꽃 피는 식물은 이중 수정을 통해 씨앗을 생산, 직접 gamete 혈장 막에 국한 단백질 사이의 상호 작용에 의해 제어되는 과정1,2. 꽃 식물 남성 gametes, 정자 세포의 쌍, 꽃가루에서 개발. 수분 후에 자라는 꽃가루 관은 배아 낭에서 발전하는 여성 gametes, 계란 세포 및 중앙 세포에 한 쌍의 정자 세포를 전달합니다. 남성과 여성의 게임들이 만난 후, gamete 표면의 단백질은 인식, 부착 및 융합을 촉진하여 이중 수정을 완료합니다. 이전 연구에서, 수컷 게임테막 단백질 생성 세포 특이적 1(GCS1)/HAPLESS2(HAP2)3,4 및 GAMETE EXPRESSED 2(GEX2)5는 게임테 융합에 관여하는 수정 조절제로서 확인되었고, 첨부 파일각각. 우리는 최근에 gamete 상호 작용에 관여하는 풍부하게 함 조정기로 남성 gamete 특이적인 막 단백질, DUF679 DOMAIN 막 단백질 9 (DMP9)를 확인했습니다. 우리는 DMP9 발현의 감소가 A. 탈리아나
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프로토콜
1. 인공 수분
참고: 프로세스를 시작하기 전에 5번 집게가 필요합니다.
- 성장 챔버에서 16-h 빛/8-h 암흑 주기 하에서 22°C에서 A. 탈리아나(Col-0)를 성장시다.
참고: 잘라 서 드 싹의 개발을 촉진 하기 위해 가위로 첫 번째 개발 된 꽃 줄기를 제거 합니다. 활발하게 성장하는 식물 (첫 번째 줄기절단 후 2-3 주, 식물 높이 약 25cm)는 분석에 적합합니다. - 분리하려면, 5 위 집게를 사용하여 단계 118 (그림 1A)에서 꽃 봉오리의 혈팔 (그림1B),꽃잎 (그림1C)및 스타멘 (그림1D)을제거하십시오. 상단에 보이는 꽃잎의 비트와 꽃봉오리가 가장 좋습니다.
참고: 적합한 여성 게임 마커 라인을 사용합니다. 이 프로토콜에서는 야생 형 식물을 여성 부모로 사용했습니다. - 방출 후 15~18시간, 필라멘트....
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결과
DMP9 KD/HTR10-mRFP로수분된 암술로부터의 난을 7-8 HAP에서 수집하고 관찰하였다.
대부분의 난란은 난자 세포 (micropylar 측) 및 중앙 세포 (charazal 끝 측) 핵 위치에서 2 개의 decondensed mRFP 표지된 정액 핵을 각각 포함했습니다 (그림3A),성공적인 이중 수정을 나타내는. 또한, 중앙 세포 핵에 decondensed mRFP 표지된 정자 핵플러스 응축된 mRFP 표지된 정자 핵을 포함하는 난자를난세포 외부의 응축된 mRFP 표지된 정자 핵(도 3B)에서 관찰하였고, 단일 수정을 나타낸다. 이중 수정에 실패한 경우, gcs1 돌연변이 정자 세포에서와 같이 .......
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토론
HTR10-mRFP 라벨은 친자 염색질(즉, 정자 세포 핵을 시각화함)이며, 이중 수정에서의 역학은7. 꽃가루 관에서 방출 직후, HTR10-mRFP 표지된 정액 핵은 아직도 응축됩니다. 그러나, 각각의 정자 핵은 가메라미에서 수정된 여성 게임테 핵과 병합시 에이치막 융합 7후3~4시간 동안 소멸된다. 수정되지 않은 정자 세포는 gcs1 정액 세포가 풍부하게 함 없이 체포되는 배아 낭에서 도시된 것과 같이 응축된 남아 있습니다 (그림3D). 보통, 비옥한 HTR10-mRFP가 꽃가루 모체로 사용될 때, 57.9% ± 17.8% (평균 ± s.d.; n = 16 암술) 7-8 HAP에서 암술의 두 개의 mRFP 표지 된 정액 신호를 포함하고, 거의 모든 신호 (97.2%) 성공적인 이중 수정을 반영하여 감밀도가 제거됩니다(그림 3A에
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 일본과학진흥회(JP17H05832~T.I.)의 후원을 받았으며, 지바대학 지바대학 의 식물화학 식물 분자과학 전략적 우선연구 추진 프로그램의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| BX51 | 올림푸스 | 에피형광 현미경 | |
| 커버 유리 | 마쓰나미 유리 | C018181 | |
| DMP9KD/HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6 | ||
| 양면 테이프 | Nichiban | NW-15S | 15mm 폭 |
| DP72 | 올림푸스 | 디지털 카메라 | |
| 집게 | Vigor | Any No. 5 집게 사용 가능 | |
| 성장 챔버 | Nihonika | LPH-411PFQDT-SP | |
| HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. ( 2007)7 | ||
| 주입 바늘 | 테루모 | NN-2719S | 27 G |
| 슬라이드 유리 | Matsunami 유리 | S9443 | |
| SZX9 | 올림푸스 | 해부 현미경 | |
| U-MRFPHQ | 올림푸스 | 형광 필터 큐브 (여기 : BP535-555, 방출 : BA570-625, 이색 거울 : DM565) | |
| UPlanFL N 40x | 올림푸스 | 대물 렌즈(NA 1.3), 오일 침지 | |
| UPlanSApo 20x | 올림푸스 | 대물 렌즈(NA 0.75), 건조 |
참고문헌
- Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H. Gamete dialogs in green lineages. Molecular Plant. 8, 1442-1454 (2015).
- Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. Fertilization mechanisms in flowering plants. Current Biology. 26, R125-R139 (2016).
- Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuro....
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