Dual DNA herskere å studere mekanismen for ribosom translokasjon med single-nukleotid oppløsning
Summary
Dual DNA linjal analysen er utviklet for å bestemme mRNA posisjon under ribosom translokasjon, som er avhengig av dissosiasjon kreftene til dannet DNA-mRNA duplexes. Med nukleotid oppløsning og mulighet til å nå begge endene av mRNA, kan den gi mekanistisk innsikt for ribosom translokasjon og granske andre nukleinsyre yre forskyvninger.
Abstract
Den ribosom translokasjon refererer til ribosomal bevegelse på mRNA av nøyaktig tre nukleotider (NT), som er det sentrale trinnet i proteinsyntese. For å undersøke mekanismen er det to vesentlige tekniske krav. For det første er enkelt-NT resolution det kanne løse normal translokasjon fra frameshifting, i løpet av hvilke det ribosom beveger av annet enn 3 NT. Den andre er evnen til å granske både inngangs-og utgangssidene til mRNA for å belyse hele bildet av translokasjon. Vi rapporterer den doble DNA linjal analysen som er basert på de kritiske dissosiasjon kreftene til DNA-mRNA duplexes, fremstilt ved Force-indusert rest magnetization spektroskopi (bedrifter). Med 2-4 pN styrke oppløsning, er den doble linjalen analysen tilstrekkelig til å skille ulike translokasjon trinn. Ved å implementere en lang linker på undersøkelser DNAs, kan de nå mRNA på motsatt side av ribosom, slik at mRNA posisjon kan bestemmes for begge sider. Derfor er den doble linjalen analysen unikt egnet til å undersøke ribosom translokasjon, og nukleinsyre syre bevegelse generelt. Vi viser representative resultater som indikerte en repeterende mRNA konformasjon og løst normal translokasjon fra frameshifting.
Introduction
Biomolecular forskyvning er en fundamental parameter i å studere mekanismen av relaterte biologiske funksjoner. Et spesielt eksempel er ribosom translokasjon1,2, der ribosom beveger seg med nøyaktig tre nukleotider (NT) på Messenger RNA (mRNA) normalt, og etter en, to eller andre tall av NT unntatt tre i tilfelle av frameshifting. Derfor kreves et molekyl linjal system med én NT-oppløsning for å skille mellom de ulike trinn størrelsene. En større utfordring er å granske den ribosom bevegelsen på både inngangs-og utgangssidene. Med andre ord, bare med et dobbelt linjal system vil vi være i stand til å avdekke om mRNA er jevnt gjenget gjennom ribosom, eller det er mellomliggende trinn der de to sidene har forskjellige trinn størrelser som fører til en kinked eller løkker mRNA konformasjon inne i ribosom.
Flere metoder er utviklet for å møte den første utfordringen med å løse ulike trinn på utgangssiden av ribosom (3 ‘ enden av mRNA). Den doble luciferase analysen løser de ulike lese rammene ved å måle forholdet mellom de resulterende forskjellige proteinene3,4. Det gjelder kun for de 3 ‘ slutten av mRNA og dermed utilstrekkelig for å gi et fullstendig bilde av translokasjon. Mass massespektrometri kan analysere ulike peptid fragmenter som konsekvensen av den tilsvarende koden rearrangements5. Men det kan ikke finne ut hvor mange NT den ribosom trekk på mRNA. The toe-utskrift analysen er en annen vanlig metode som bruker en omvendt transkriptase primet på 3 ‘-Trykk enden å transkribere den mRNA mot ribosom6. Det er imidlertid ikke aktuelt for 5 ‘ slutten av mRNA som går inn i ribosom. Andre teknikker, inkludert enkelt molekyl tilnærminger og fluorescens metoder7, er vanskelig å oppnå én-NT oppløsning.
Vi har utviklet den doble DNA linjal analysen som kan unikt bestemme både inngangen og exit posisjoner av avdekket mRNA i ribosom-mRNA komplekser. Herskeren DNAs er DNA-oligomers som danner duplexes av visse antall basepairs (BP) med mRNA avdekket av ribosom, uavhengig av hvilken ende av mRNA. BP tallene så nøyaktig avslører ribosom posisjon på mRNA under translokasjon. BP tallene for duplexes bestemmes av deres kritiske dissosiasjon styrker innhentet fra Force-indusert rest magnetization spektroskopi (bedrifter)8. Med 2-3 pN Force usikkerhet, de kritiske kreftene er tilstrekkelige til å tilby én-NT oppløsning. Ved å implementere en linker molekyl på DNA herskere, sterically hindret siden av mRNA av ribosom kan være analysert. Ulike ribosomal forskyvninger kan dermed bli nøyaktig løst. Vi har med hell avslørt en unik repeterende konformasjon av mRNA fanget av antibiotika under translokasjon9, og løst ulike lese RAM mer som coexisted på en glatt mRNA sekvens10. Denne artikkelen beskriver detaljene i dual Ruler analysen, som inkluderer utarbeidelse av ribosom komplekser, overflate funksjonalisering av glass lysbilder, immobilisering av ribosom komplekser og deres hybridisering med magnetisk merket DNA hersker molekyler, magnetisk deteksjon, og styrke spektrum analyse av bedrifter.
Protocol
Representative Results
Discussion
I vår dual linjal analysen, magnetiske perler spille to viktige roller. Først tjener de som kraft transdusere fordi Sentrifugalkraften er proporsjonal med deres spenstig masse. Sekund, perlene er signal bærere oppdages av en Atomic Magnetometer, som for tiden er den mest nøyaktige magnetisk sensor. Kombinere mekanisk manipulasjon og magnetisk deteksjon, er det bedrifter teknikken i stand til å løse et stort antall molekylære interaksjoner basert på deres kritiske dissosiasjon styrker, som er grunnlaget for DNA he…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet er støttet av det amerikanske National Institutes of Health (R01GM111452, Y.W., S.X.). Y. W. erkjenner støtte fra Welch Foundation (E-1721).
Materials
| Styrene Strip | City of Industry | MS-861 | |
| Glass slides | Evaporated Coatings | 60.0 × 4.0 × 0.3 mm3 | |
| Acetic acid | Millipore Sigma | A6283-500ML | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane | UCT specialties | 21400088 | |
| mPEG-SVA | Laysan Bio | 154-82 | |
| Biotin-PEG-SVA | Laysan Bio | 152-84 | |
| Sodium bicarbonate | Millipore Sigma | S5761-500G | |
| Epoxy glue | Devcon | 31345 | |
| Streptavidin | ThermoFisher | 434301 | |
| Fusidic Acid | Millipore Sigma | F0756-1G | |
| Neomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1458009 | |
| Viomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1715000 | |
| Hygromycin | invitrogen | 10687-010 | |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941-100G | |
| Magnesium acetate | Millipore Sigma | M5661-50G | |
| Ammonium chloride | Millipore Sigma | A9434-500G | |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | P9333-500G | |
| EDTA | GIBCO | 774750 | |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-500ML | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-250ML | |
| GTP | Millipore Sigma | G8877-100MG | |
| PEP | Millipore Sigma | P7127-100MG | |
| Pyruvate Kinase | Millipore Sigma | P1506-5KU | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S7903-5KG | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | ThermoFisher | 11205D | |
| mRNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 133899727 | 5′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468630 | 3ʹ- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5ʹ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 164845370 | 3ʹ-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468628 | 3ʹ-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 163472705 | 3ʹ-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678130 | 3ʹ-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678131 | 3ʹ-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678132 | 3ʹ-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5ʹ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678133 | 3ʹ-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| Centrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Micro Ultracentrifuge | Hitachi | CS150FNX | |
| Vortex mixer | VWR | VM-3000 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR530 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR830 | |
| Laser | Newport | TLB-6918-D | |
| Function generator | Stanford Research Systems | DS345 | |
| Photo detectors | Thorlabs | DET36A |
References
- Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA. Quarterly Review of Biophysics. 50, 12 (2017).
- Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F. How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation. Science. 345, 1188-1191 (2014).
- Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals. RNA. 4, 479-486 (1998).
- Fang, Y., Treffers, E. E., Li, Y., Tas, A., Sun, Z., van der Meer, Y., de Ru, A. H., van Veelen, P. A., Atkins, J. F., Snijder, E. J., Firth, A. E. Efficient -2 frameshifting by mammalian ribosomes to synthesize an additional arterivirus protein. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 2920-2928 (2012).
- Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways. Cell. 160, 870-881 (2015).
- Shirokikh, N. E., Alkalaeva, E. Z., Vassilenko, K. S., Afonina, Z. A., Alekhina, O. M., Kisselev, L. L., Spirin, A. S. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Research. 38, 15 (2010).
- Chen, J., et al. Dynamic pathways of -1 translational frameshifting. Nature. 512, 328-332 (2014).
- De Silva, L., Yao, L., Wang, Y., Xu, S. Well-defined and sequence-specific noncovalent binding forces of DNA. Journal of Physical Chemistry B. 117, 7554-7558 (2013).
- Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers reveal an “mRNA looping” intermediate state during ribosome translocation. RNA Biology. 15, 1392-1398 (2018).
- Tsai, T. W., Yang, H., Yin, H., Xu, S., Wang, Y. High-efficiency “-1” and “-2” ribosomal frameshiftings revealed by force spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12, 1629-1635 (2017).
- Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99, 3002-3009 (2010).
- Garcia, N. C., Yu, D., Yao, L., Xu, S. Optical atomic magnetometer at body temperature for magnetic particle imaging and nuclear magnetic resonance. Optics Letters. 35, 661-663 (2010).
- Yao, L., Xu, S. Long-range, high-resolution magnetic imaging of nanoparticles. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5679-5682 (2009).
- Kurkcuoglu, O., Doruker, P., Sen, T. Z., Kloczkowski, A., Jernigan, R. L. The ribosome structure controls and directs mRNA entry, translocation and exit dynamics. Physical Biology. 5, 046005 (2008).
- Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475, 118-121 (2011).
- Jacks, T., et al. Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression. Nature. 331, 280-283 (1988).
- Schuwirth, B. S., et al. Structures of the bacterial ribosome at 3.5 Å resolution. Science. 310, 827-834 (2005).
- Jia, H., Wang, Y., Xu, S. Super-resolution force spectroscopy reveals ribosomal motion at sub-nucleotide steps. Chemical Communications. 54, 5883-5886 (2018).
