Bruk av viral Entry analyser og molekylær docking analyse for identifisering av antivirale kandidater mot coxsackievirus A16
Summary
Målet med protokollen er å illustrere de ulike analysene knyttet til viral oppføring som kan brukes til å identifisere kandidat viral oppføring hemmere.
Abstract
Antivirale analyser som mechanistically undersøke viral oppføring er relevant å skjelne på hvilke trinn de evaluerte agentene er mest effektive, og tillater identifisering av kandidat viral oppføring hemmere. Her presenterer vi den eksperimentelle tilnærminger for identifisering av små molekyler i stand til å blokkere smitte av ikke-innhyllet coxsackievirus A16 (CVA16) gjennom målretting viruset partikler eller bestemte trinn i tidlig viral oppføring. Analyser inkluderer tid-av-stoff-tillegg analyse, flyt flowcytometri-baserte viral bindende analysen, og viral inaktive analysen. Vi presenterer også en molekylær docking-protokoll utnytte virus kapsid proteiner å forutsi potensielle rester målrettet av antivirale forbindelser. Disse analysene bør bidra i identifisering av kandidat antivirale midler som virker på viral oppføring. Fremtidige retninger kan utforske disse mulige hemmere for videre narkotika utvikling.
Introduction
Hånd-, fot-og munn sykdom (HFMD) er en sykdom som oftest forårsakes av coxsackievirus A16 (CVA16) og enterovirus 71 (EV71) hos små barn. Nylig over Asia-Pacific-regionen, har det vært en betydelig uptick i CVA16-indusert HFMD. Mens symptomene kan være milde, kan alvorlige komplikasjoner oppstå som påvirker hjernen og hjertet, med potensiell dødsulykke1,2. I dag er det ingen lisensierte antivirale behandlinger eller vaksiner tilgjengelig for CVA16, og dermed er det et presserende behov for å utvikle antivirale strategier for å dempe fremtidige utbrudd og tilhørende komplikasjoner.
CVA16 er en ikke-innhyllet virus som har en icosahedral kapsid samlet fra pentamers at hver inneholder 4 strukturelle proteiner nemlig VP1, VP2, VP3, og VP4. Omringe hver fem ganger aksen i pentamer er en “Canyon”-regionen som viser som en depresjon og er kjent for sin rolle i reseptor binding3. På bunnen av denne Canyon ligger en hydrofobe lomme i VP1 regionen som inneholder en naturlig fet ligand navngitt sfingosin (SPH). Cellular reseptorer, som menneskelige P selectin glykoprotein ligand 1 (PSGL-1) og renovasjonsarbeider reseptor klasse B-medlem 2 (SCARB2), har blitt foreslått å spille en rolle i viral bindende ved å fortrenge dette ligand som resulterer i conformational endringer i kapsid og påfølgende utstøting av viral Genova inn i Host Cell4,5,6. Identifisering mulig hemmere som blokkerer påfølgende hendelser i viral oppføring prosessen kunne gi potensielle terapeutiske strategier mot CVA16 infeksjon.
Trinnene i viruset livssyklus kan bli dissekert gjennom eksperimentelle tilnærminger som mål for å identifisere modus-spesifikke antivirale midler. En tid-av-stoff-tillegg analyse undersøker stoffet behandling effekt på ulike tidspunkter under viral infeksjon, inkludert pre-Entry (lagt før virus infeksjon), oppføring (lagt samtidige til virus infeksjon), og post-Entry (lagt etter virus infeksjon)7. Virkningen kan vurderes ved hjelp av en standard plakk analysen ved kvantitere antall viral plaketter dannet i hver av behandlings forhold. Flyten flowcytometri-baserte viral bindende analysen avgjør om stoffet hindrer viral vedlegg til vert celler. Dette oppnås ved å flytte temperaturen fra 37 ° c, der flertallet av humant virusinfeksjoner oppstår, til 4 ° c, der virions er i stand til å binde til verts celleoverflaten, men ikke kan gå inn i cellene7. Virus partiklene som er bundet til cellemembranen blir deretter kvantifisert gjennom immunostaining mot viral antigener og vurderes av strømnings flowcytometri. Den viral inaktive analysen på den annen side bidrar til å vurdere potensielle fysiske interaksjoner av stoffet med gratis virus partikler, enten skjerming eller nøytralisere virions, eller forårsaker samlinger eller conformational endringer som gjør dem inaktive for påfølgende interaksjoner med verts celleoverflaten under infeksjonen8,9. I dette eksperimentet, viral inokulum er lov til å først ruge med stoffet før de blir fortynnet til titrere ut stoffet før infisere verten celle monolag og utføre en standard plakk analysen8. Til slutt, molekylær docking er et kraftig verktøy for å forutsi potensielle narkotika interaksjon nettsteder på virionet overflaten, inkludert viral glykoproteiner fra innhyllet virus og viral kapsid proteiner fra ikke-innhyllet virus, ved hjelp av beregningsorientert Algoritmer. Dette bidrar til å mechanistically mål av stoffets handlings modus og gi nyttig informasjon som kan bli ytterligere validert av nedstrøms analyser.
Vi har nylig ansatt ovenfor beskrevet metoder for å identifisere antivirale forbindelser som effektivt blokkerte smitte av ikke-innhyllet CVA169. I dette dokumentet beskrives og diskuteres de detaljerte protokollene som ble brukt.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne rapporten, beskrev vi protokollene som er nyttige for identifisering av antivirale kandidater som mål viral oppføring, spesielt mot ikke-innhyllet CVA16. Analysene er utformet på måter å analysere de tidlige hendelsene under viral oppføring, noe som er nyttig å avklare mekanismen (e) av handlingen og potensielle mål (er) av test agentene ‘ antiviral aktivitet. The ‘ time-of-Drug-tillegg analysen ‘ tillater å bredt bestemme potensialet målet av testen forbindelser, for eksempel infisert verten celler (fo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne er takknemlige for Dr. Joshua Beckham ved University of Texas i Austin for teknisk støtte med molekylær docking. Denne studien ble delvis støttet av finansiering fra departementet for vitenskap og teknologi i Taiwan (MOST107-2320-B-037-002 til C.-JL og L.-T.L.; MOST106-2320-B-038-021 og MOST107-2320-B-038-034-MY3 til L.-T.L.).
Materials
| 4% Paraformaldehyde | Sigma | AL-158127-500G | |
| Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG | Invitrogen | A11029 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| Anti-VP1 antibody | Merck-Millipore | MAB979 | Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D |
| Beckman Coulter Cytometer | Beckman Coulter | FC500 | |
| Corina | Molecular Networks GmbH | ||
| Crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | GIBCO | 11995-040 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Graphpad Prism | GraphPad | ||
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| In vitro toxicology assay kit, XTT-based | Sigma | TOX2 | |
| Methylcellulose | Sigma | M0512-100G | |
| PBS pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070-063 | |
| PyMol | Schrödinger | ||
| UCSF Chimera | University of California, San Francisco |
References
- Legay, F., et al. Fatal coxsackievirus A-16 pneumonitis in adult. Emerging Infectious Diseases. 13, 1084-1086 (2007).
- Wang, C. Y., Li Lu, ., Wu, F., H, M., Lee, C. Y., Huang, L. M. Fatal coxsackievirus A16 infection. Pediatric Infectious Disease Journal. 23, 275-276 (2004).
- Ren, J., et al. Structures of coxsackievirus A16 capsids with native antigenicity: implications for particle expansion, receptor binding, and immunogenicity. Journal of Virology. 89, 10500-10511 (2015).
- Nishimura, Y., et al. Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 794-797 (2009).
- Yamayoshi, S., et al. Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 798-801 (2009).
- Yamayoshi, S., et al. Human SCARB2-dependent infection by coxsackievirus A7, A14, and A16 and enterovirus 71. Journal of Virology. 86, 5686-5696 (2012).
- Lin, L. T., et al. Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread. Journal of Virology. 85, 4386-4398 (2011).
- Lin, L. T., et al. Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry. BMC Microbiology. 13, 187 (2013).
- Lin, C. J., et al. Small molecules targeting coxsackievirus A16 capsid inactivate viral particles and prevent viral binding. Emerging Microbes & Infections. 7, 162 (2018).
- Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. . Principles of Virology. , (2008).
- Velu, A. B., et al. BPR-3P0128 inhibits RNA-dependent RNA polymerase elongation and VPg uridylylation activities of Enterovirus 71. Antiviral Research. 112, 18-25 (2014).
- Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. Journal of Visualized Experiments. , e53124 (2015).
- Lang, P. T., et al. DOCK 6: combining techniques to model RNA-small molecule complexes. RNA. 15, 1219-1230 (2009).
- Zhang, X., et al. Coxsackievirus A16 utilizes cell surface heparan sulfate glycosaminoglycans as its attachment receptor. Emerging Microbes & Infections. 6, 65 (2017).
- Waterhouse, A., et al. SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes. Nucleic Acids Research. 46, W296-W303 (2018).
