Coxsackievirus 'a karşı antiviral adayların tanımlanması için viral giriş analizinin kullanımı ve moleküler yerleştirme Analizi A16
Summary
Protokol amacı, aday viral giriş inhibitörleri tanımlamak için kullanılabilecek viral giriş ile ilgili farklı deneyleri göstermek için.
Abstract
Antiviral bir mekanik viral giriş incelemek için hangi adım değerlendirilen ajanlar en etkili olduğunu ayırt etmek için uygun olduğunu, ve aday viral giriş inhibitörleri tanımlanması için izin asdiyor. Burada, virüs parçacıklarını veya erken viral girişteki belirli adımları hedefleyerek, zarfsız coxsackievirus A16 (CVA16) tarafından enfeksiyonun engellenebilen küçük moleküllerin tanımlanması için deneysel yaklaşımlar sunuyoruz. Assays zaman-of-ilaç-ilavesi analizi, akış sitometri tabanlı viral bağlayıcı tahlil ve viral inaktivasyon assay içerir. Ayrıca, antiviral bileşiklerin hedeflediği potansiyel kalıntıları tahmin etmek için virüs kapsid proteinlerini kullanan bir moleküler yerleştirme Protokolü sunuyoruz. Bu tanıtım viral giriş üzerinde hareket aday antiviral ajanlar tanımlanmasını yardımcı olmalıdır. Gelecek yönleri daha fazla ilaç gelişimi için bu olası inhibitörleri keşfedebilirsiniz.
Introduction
El, ayak ve ağız hastalığı (HFMD), küçük çocuklarda coxsackievirus A16 (CVA16) ve enterovirüs 71 (EV71) tarafından en sık neden olan bir hastalıktır. Son zamanlarda Asya-Pasifik Bölgesi genelinde, CVA16 kaynaklı HFMD ‘de önemli bir Uptick olmuştur. Belirtiler hafif olabilir iken, şiddetli komplikasyonlar beyin ve kalp etkileyen oluşabilir, potansiyel Fatality ile1,2. Şu anda, hiçbir lisanslı antiviral tedaviler veya aşılar CVA16 için mevcut, ve bu nedenle bir baskı ihtiyacı gelecek salgınlar ve ilişkili komplikasyonlar frenlemek için antiviral stratejiler geliştirmek için vardır.
CVA16 bir icosahedral kapsid her biri 4 yapısal proteinleri yani VP1, VP2, VP3 ve VP4 içeren pentam montajlı bir olmayan zarflı virüs. Pentamer her beş kat ekseni çevreleyen bir ‘ Kanyon ‘ bölge bir depresyon olarak gösterir ve reseptör bağlayıcı rolü için belirtilmiştir3. Bu kanyon altında bir hidrofobik cep yatıyor VP1 bölgede doğal bir yağ ligand adlı sphingosine (SPH) içerir. Cellular reseptörleri, insan P selektin glikoprotein ligand 1 (psgl-1) ve çöpçü reseptör sınıf B üyesi 2 (SCARB2) gibi, bu ligand yerinden tarafından viral bağlayıcı bir rol oynamak için önerilmiştir hangi kapsid ve Konformasyonel değişiklikler sonuçlanır viral genomu daha sonra ev sahibi hücreye4,5,6. Viral giriş sürecinde ardışık olayları engelleyen olası inhibitörleri tanımlamak CVA16 enfeksiyonuna karşı potansiyel terapötik stratejiler sağlayabilir.
Virüs yaşam döngüsünde adımlar, mod özgü antiviral ajanlar tanımlamanıza yardımcı olmak için hedefler olarak deneysel yaklaşımlar üzerinden disseke olabilir. Bir zaman-of-ilaç-ek analiz viral enfeksiyon sırasında farklı zamanlarda ilaç tedavi etkisini inceler, ön giriş de dahil olmak üzere (virüs enfeksiyonu önce eklendi), giriş (virüs enfeksiyonu eşzamanlı eklendi), ve sonrası giriş (aşağıdaki eklendi virüs enfeksiyonu)7. Etkisi her tedavi koşullarında oluşan viral plaklar sayısını quantitating standart bir plak tahlil kullanılarak değerlendirilebilir. Akış cytometry tabanlı viral bağlayıcı tahlil ilaç ev sahibi hücrelere viral eki önler Eğer belirler. Bu, insan virüsü enfeksiyonlarının çoğunun oluştuğu 37 °C ‘ den gelen sıcaklığı, viriyonların ana hücre yüzeyine bağlanabildiği ancak hücreleri7‘ ye giremeyeceği 4 °c ‘ ye kadar kaydırarak elde edilir. Hücre membranı bağlı virüs parçacıkları daha sonra viral antijenlere karşı immünostatif ile ölçülmüş ve akış sitometri tarafından değerlendirilir. Diğer taraftan viral inaktivasyon assay ücretsiz virüs parçacıkları ile ilacın potansiyel fiziksel etkileşimlerini değerlendirmek için yardımcı olur, ya kalkanlama ya da virions nötralize, ya da neden toplamalardan ya da onları etkin hale getirmek Konformasyonel değişiklikleri enfeksiyon sırasında ana hücre yüzeyi ile sonraki etkileşimleri8,9. Bu deneyde, viral inokulumunu ilk ilaç ile ana hücre tek tabakalı enfekte ve standart bir plak tahlil8gerçekleştirmeden önce ilaç dışarı titrat için seyreltilmiş olmak için izin verilir. Son olarak, moleküler yerleştirme virion yüzeyinde potansiyel uyuşturucu etkileşimi sitelerini tahmin etmek için güçlü bir araçtır, zarflı virüslerden viral glikoproteinler ve non-zarf virüslerden viral kapsid proteinleri dahil, Hesaplamalı kullanarak Algoritma. Bu mekanik ilaç eylem modu hedeflerini belirlemek için yardımcı olur ve daha fazla aşağı akım assays tarafından doğrulanabilir yararlı bilgiler sağlar.
Son zamanlarda etkili olmayan zarflı CVA169tarafından enfeksiyon bloke antiviral bileşikler tanımlamak için yukarıda açıklanan yöntemleri istihdam. Burada, kullanılan ayrıntılı protokoller açıklanmıştır ve tartışılmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu raporda, viral giriş hedefleyen antiviral adayların tanımlanması için yararlı olan protokolleri tarif, özellikle olmayan zarflı CVA16 karşı. Deneyleri viral giriş sırasında erken olayları incelemek için şekillerde tasarlanmıştır, hangi eylem mekanizması (ler) açıklığa kavuşturmak için yararlıdır ve potansiyel hedef (ler) test ajanları ‘ antiviral aktivite. ‘ Zaman-of-ilaç-ek tahlil ‘ büyük ölçüde test bileşiklerinin potansiyel hedefini belirlemek için izin verir, örneğin enfekte …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Dr Joshua Beckham için Austin Texas Üniversitesi ‘nde moleküler yerleştirme ile teknik destek için minnettar. Bu çalışmada, Tayvan bilim ve Teknoloji Bakanlığı (MOST107-2320-B-037-002-C.-JL ve L.-m. ‘ den fon tarafından kısmen destekleniyordu; MOST106-2320-B-038-021 ve MOST107-2320-B-038-034-MY3 için L.-m).
Materials
| 4% Paraformaldehyde | Sigma | AL-158127-500G | |
| Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG | Invitrogen | A11029 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| Anti-VP1 antibody | Merck-Millipore | MAB979 | Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D |
| Beckman Coulter Cytometer | Beckman Coulter | FC500 | |
| Corina | Molecular Networks GmbH | ||
| Crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | GIBCO | 11995-040 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Graphpad Prism | GraphPad | ||
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| In vitro toxicology assay kit, XTT-based | Sigma | TOX2 | |
| Methylcellulose | Sigma | M0512-100G | |
| PBS pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070-063 | |
| PyMol | Schrödinger | ||
| UCSF Chimera | University of California, San Francisco |
References
- Legay, F., et al. Fatal coxsackievirus A-16 pneumonitis in adult. Emerging Infectious Diseases. 13, 1084-1086 (2007).
- Wang, C. Y., Li Lu, ., Wu, F., H, M., Lee, C. Y., Huang, L. M. Fatal coxsackievirus A16 infection. Pediatric Infectious Disease Journal. 23, 275-276 (2004).
- Ren, J., et al. Structures of coxsackievirus A16 capsids with native antigenicity: implications for particle expansion, receptor binding, and immunogenicity. Journal of Virology. 89, 10500-10511 (2015).
- Nishimura, Y., et al. Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 794-797 (2009).
- Yamayoshi, S., et al. Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 798-801 (2009).
- Yamayoshi, S., et al. Human SCARB2-dependent infection by coxsackievirus A7, A14, and A16 and enterovirus 71. Journal of Virology. 86, 5686-5696 (2012).
- Lin, L. T., et al. Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread. Journal of Virology. 85, 4386-4398 (2011).
- Lin, L. T., et al. Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry. BMC Microbiology. 13, 187 (2013).
- Lin, C. J., et al. Small molecules targeting coxsackievirus A16 capsid inactivate viral particles and prevent viral binding. Emerging Microbes & Infections. 7, 162 (2018).
- Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. . Principles of Virology. , (2008).
- Velu, A. B., et al. BPR-3P0128 inhibits RNA-dependent RNA polymerase elongation and VPg uridylylation activities of Enterovirus 71. Antiviral Research. 112, 18-25 (2014).
- Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. Journal of Visualized Experiments. , e53124 (2015).
- Lang, P. T., et al. DOCK 6: combining techniques to model RNA-small molecule complexes. RNA. 15, 1219-1230 (2009).
- Zhang, X., et al. Coxsackievirus A16 utilizes cell surface heparan sulfate glycosaminoglycans as its attachment receptor. Emerging Microbes & Infections. 6, 65 (2017).
- Waterhouse, A., et al. SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes. Nucleic Acids Research. 46, W296-W303 (2018).
