استخدام اختبارات دخول الفيروسية وتحليل الإرساء الجزيئي لتحديد المرشحين المضادة للفيروسات ضد فيروس كوكساكي A16
Summary
والهدف من البروتوكول هو توضيح الاختبارات المختلفة المتعلقة بالدخول الفيروسي التي يمكن استخدامها لتحديد مثبطات دخول الفيروس المرشح.
Abstract
الاختبارات المضادة للفيروسات التي تفحص ميكانيكيا دخول الفيروسية هي ذات الصلة لتحديد في أي خطوة العوامل التي تم تقييمها هي الأكثر فعالية، والسماح لتحديد مثبطات دخول الفيروسية المرشح. هنا، نقدم النهج التجريبية لتحديد الجزيئات الصغيرة القادرة على منع العدوى من قبل فيروس كوكساكي A16 غير المغلفة (CVA16) من خلال استهداف جزيئات الفيروس أو خطوات محددة في دخول الفيروس في وقت مبكر. وتشمل الاختبارات تحليل وقت إضافة المخدرات، والتدفق القائم على قياس السيتومتري اختبار ملزم الفيروسية، والتنبؤ بالتعطيل الفيروسي. كما نقدم بروتوكول الإرساء الجزيئي باستخدام بروتينات كابسيد الفيروس للتنبؤ بالمخلفات المحتملة التي تستهدفها المركبات المضادة للفيروسات. وينبغي أن تساعد هذه الاختبارات في تحديد العوامل المضادة للفيروسات المرشحة التي تعمل على دخول الفيروسية. ويمكن للاتجاهات المستقبلية أن تستكشف هذه المثبطات الممكنة لمزيد من تطوير العقاقير.
Introduction
أمراض اليد والقدم والفم (HFMD) هو المرض الأكثر شيوعا الناجمة عن فيروس كوكساكي A16 (CVA16) والفيروس المعوي 71 (EV71) في الأطفال الصغار. وفي الآونة الأخيرة في جميع أنحاء منطقة آسيا والمحيط الهادئ، حدث ارتفاع كبير في HFMD الذي يسببه CVA16. في حين يمكن أن تكون الأعراض خفيفة، يمكن أن تحدث مضاعفات شديدة تؤثر على الدماغ والقلب، مع احتمال الوفاة1،2. في الوقت الحاضر، لا توجد علاجات مضادة للفيروسات مرخصة أو التطعيمات المتاحة لCVA16، وبالتالي هناك حاجة ملحة لوضع استراتيجيات مضادة للفيروسات للحد من تفشي الأمراض في المستقبل والمضاعفات المرتبطة بها.
CVA16 هو فيروس غير مغلف الذي يحتوي على capsid icosahedral تجميعها من pentamers أن كل تحتوي على 4 البروتينات الهيكلية وهي VP1، VP2، VP3، و VP4. تطويق كل محور خمسة أضعاف في الخماسي هو منطقة ‘الوادي’ التي تظهر كالاكتئاب ويلاحظ لدورها في مستقبلات ملزمة3. في الجزء السفلي من هذا الوادي يكمن جيب الكاره للماء في منطقة VP1 التي تحتوي على الرباط الدهنية الطبيعية المسماة sphingosine (SPH). مستقبلات الخلوية، مثل الإنسان P selectin غليكوزيبروتين ليكاند 1 (PSGL-1) ومستقبلات الزبال فئة B عضو 2 (SCARB2)، وقد اقترح للعب دور في الربط الفيروسي عن طريق إزاحة هذا الرباط الذي يؤدي إلى تغييرات المطابقة إلى كابسيد و طرد لاحق من الجينوم الفيروسي في الخلية المضيفة4،5،6. تحديد مثبطات المحتملة التي تمنع الأحداث المتعاقبة في عملية دخول الفيروسية يمكن أن توفر استراتيجيات علاجية محتملة ضد عدوى CVA16.
ويمكن تشريح الخطوات في دورة حياة الفيروس من خلال النهج التجريبية كأهداف للمساعدة في تحديد العوامل المضادة للفيروسات الخاصة بالوضع. تحليل وقت إضافة المخدرات يفحص تأثير العلاج من المخدرات في أوقات مختلفة خلال العدوى الفيروسية، بما في ذلك ما قبل الدخول (أضيف قبل العدوى بالفيروس)، والدخول (إضافة متزامنة إلى عدوى الفيروس)، وبعد الدخول (أضيفت بعد دخول عدوى الفيروس)7. يمكن تقييم التأثير باستخدام فحص البلاك القياسي عن طريق تحديد عدد اللويحات الفيروسية التي تشكلت في كل حالة من شروط العلاج. يحدد فحص الربط الفيروسي القائم على قياس الخلايا ما إذا كان الدواء يمنع التعلق الفيروسي بالخلايا المضيفة. ويتحقق ذلك عن طريق تحويل درجة الحرارة من 37 درجة مئوية، التي تحدث فيها غالبية عدوى الفيروس البشري، إلى 4 درجة مئوية، حيث تكون virions قادرة على ربط سطح الخلية المضيفة ولكنها غير قادرة على دخول الخلايا7. ثم يتم قياس جزيئات الفيروس المرتبطة بغشاء الخلية كمياً من خلال التلطيخ المناعي ضد المستضدات الفيروسية وتقييمها عن طريق قياس التدفق الخلوي. اختبار التعطيل الفيروسي من ناحية أخرى يساعد على تقييم التفاعلات المادية المحتملة للدواء مع جزيئات الفيروس الحرة، إما حماية أو تحييد virions، أو التسبب في التجمعات أو التغيرات المطابقة التي تجعلها غير نشطة ل التفاعلات اللاحقة مع سطح الخلية المضيفة أثناء العدوى8،9. في هذه التجربة ، يسمح للابوتان الفيروسي باحتضان الدواء لأول مرة قبل تخفيفه لمعايرة الدواء قبل إصابة الخلية المضيفة أحادية الطبقة وإجراء فحص البلاك القياسي8. وأخيرا، الإرساء الجزيئي هو أداة قوية للتنبؤ مواقع التفاعل المخدرات المحتملة على سطح فيريون، بما في ذلك البروتينات السكرية الفيروسية من الفيروسات المغلفة والبروتينات كابسيد الفيروسية من الفيروسات غير المغلفة، وذلك باستخدام الحسابية خوارزميات. وهذا يساعد على تحديد الأهداف الآلية لطريقة عمل الدواء وتوفير معلومات مفيدة يمكن التحقق من صحتها من خلال الاختبارات النهائية.
لقد استخدمنا مؤخرا الأساليب المذكورة أعلاه لتحديد المركبات المضادة للفيروسات التي منعت بكفاءة العدوى من قبل CVA169غير مغلفة . هنا، يتم وصف البروتوكولات التفصيلية التي تم استخدامها ومناقشتها.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا التقرير، وصفنا البروتوكولات التي هي مفيدة لتحديد المرشحين المضادة للفيروسات التي تستهدف دخول الفيروسية، ولا سيما ضد CVA16 غير مغلفة. تم تصميم الاختبارات بطرق لتشريح الأحداث المبكرة أثناء الدخول الفيروسي، وهو أمر مفيد لتوضيح آلية (آليات) العمل والأهداف المحتملة للنشاط المضاد للفيرو?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشعر المؤلفون بالامتنان للدكتور جوشوا بيكهام في جامعة تكساس في أوستن على الدعم التقني مع الإرساء الجزيئي. وقد تم دعم هذه الدراسة جزئيا بتمويل من وزارة العلوم والتكنولوجيا في تايوان (MOST107-2320-B-037-002 إلى C.J.L. و L.T.L.; MOST106-2320-B-038-021 وMOST107-2320-B-038-034-MY3 إلى L.-T.L.).
Materials
| 4% Paraformaldehyde | Sigma | AL-158127-500G | |
| Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG | Invitrogen | A11029 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| Anti-VP1 antibody | Merck-Millipore | MAB979 | Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D |
| Beckman Coulter Cytometer | Beckman Coulter | FC500 | |
| Corina | Molecular Networks GmbH | ||
| Crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | GIBCO | 11995-040 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Graphpad Prism | GraphPad | ||
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| In vitro toxicology assay kit, XTT-based | Sigma | TOX2 | |
| Methylcellulose | Sigma | M0512-100G | |
| PBS pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070-063 | |
| PyMol | Schrödinger | ||
| UCSF Chimera | University of California, San Francisco |
References
- Legay, F., et al. Fatal coxsackievirus A-16 pneumonitis in adult. Emerging Infectious Diseases. 13, 1084-1086 (2007).
- Wang, C. Y., Li Lu, ., Wu, F., H, M., Lee, C. Y., Huang, L. M. Fatal coxsackievirus A16 infection. Pediatric Infectious Disease Journal. 23, 275-276 (2004).
- Ren, J., et al. Structures of coxsackievirus A16 capsids with native antigenicity: implications for particle expansion, receptor binding, and immunogenicity. Journal of Virology. 89, 10500-10511 (2015).
- Nishimura, Y., et al. Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 794-797 (2009).
- Yamayoshi, S., et al. Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 798-801 (2009).
- Yamayoshi, S., et al. Human SCARB2-dependent infection by coxsackievirus A7, A14, and A16 and enterovirus 71. Journal of Virology. 86, 5686-5696 (2012).
- Lin, L. T., et al. Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread. Journal of Virology. 85, 4386-4398 (2011).
- Lin, L. T., et al. Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry. BMC Microbiology. 13, 187 (2013).
- Lin, C. J., et al. Small molecules targeting coxsackievirus A16 capsid inactivate viral particles and prevent viral binding. Emerging Microbes & Infections. 7, 162 (2018).
- Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. . Principles of Virology. , (2008).
- Velu, A. B., et al. BPR-3P0128 inhibits RNA-dependent RNA polymerase elongation and VPg uridylylation activities of Enterovirus 71. Antiviral Research. 112, 18-25 (2014).
- Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. Journal of Visualized Experiments. , e53124 (2015).
- Lang, P. T., et al. DOCK 6: combining techniques to model RNA-small molecule complexes. RNA. 15, 1219-1230 (2009).
- Zhang, X., et al. Coxsackievirus A16 utilizes cell surface heparan sulfate glycosaminoglycans as its attachment receptor. Emerging Microbes & Infections. 6, 65 (2017).
- Waterhouse, A., et al. SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes. Nucleic Acids Research. 46, W296-W303 (2018).
