Coxsackievirus A16 के खिलाफ एंटीवायरल उम्मीदवारों की पहचान के लिए वायरल प्रविष्टि परख और आणविक डॉकिंग विश्लेषण का उपयोग
Summary
प्रोटोकॉल का लक्ष्य वायरल प्रविष्टि है कि उम्मीदवार वायरल प्रविष्टि inhibitors की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है से संबंधित विभिन्न परख वर्णन है.
Abstract
एंटीवायरल का कहना है कि यंत्रवत् वायरल प्रविष्टि की जांच करने के लिए उचित है, जिस पर मूल्यांकन एजेंट सबसे प्रभावी हैं, और उम्मीदवार वायरल प्रविष्टि अवरोधकों की पहचान के लिए अनुमति देते हैं। यहाँ, हम वायरस कणों या जल्दी वायरल प्रविष्टि में विशिष्ट चरणों को लक्षित करने के माध्यम से गैर-enveloped coxsackievirus A16 (CVA16) द्वारा संक्रमण को अवरुद्ध करने में सक्षम छोटे अणुओं की पहचान के लिए प्रयोगात्मक दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं। परख समय के दवा-योग विश्लेषण, प्रवाह साइटोमेट्री आधारित वायरल बाध्यकारी परख, और वायरल निष्क्रियता परख शामिल हैं. हम एंटीवायरल यौगिकों द्वारा लक्षित संभावित अवशेषों की भविष्यवाणी करने के लिए वायरस कैप्सिड प्रोटीन का उपयोग करने के लिए एक आणविक डॉकिंग प्रोटोकॉल भी प्रस्तुत करते हैं। ये परख ों यावायरल एजेंटों की पहचान करने में मदद करनी चाहिए जो वायरल प्रविष्टि पर कार्य करते हैं। भविष्य की दिशाओं आगे दवा के विकास के लिए इन संभव inhibitors का पता लगाने कर सकते हैं.
Introduction
हाथ, पैर, और मुंह की बीमारी (HFMD) एक रोग सबसे अधिक coxsackievirus A16 (CVA16) और enterovirus 71 (EV71) छोटे बच्चों में की वजह से है. हाल ही में एशिया-प्रशांत क्षेत्र में, सीवीए 16 प्रेरित HFMD में एक महत्वपूर्ण उछाल रहा है। जबकि लक्षण हल्के हो सकते हैं, गंभीर जटिलताएं हो सकती हैं जो मस्तिष्क और दिल को प्रभावित करती हैं, संभावित घातकता1,2के साथ । वर्तमान में, सीवीए 16 के लिए कोई लाइसेंस एंटीवायरल उपचार या टीकाकरण उपलब्ध नहीं है, और इस प्रकार भविष्य के प्रकोपों और संबंधित जटिलताओं को रोकने के लिए एंटीवायरल रणनीतियों को विकसित करने की आवश्यकता है।
CVA16 एक गैर-enveloped वायरस है जो एक icosahedral capsid pentamers से इकट्ठे हुए है कि प्रत्येक 4 संरचनात्मक प्रोटीन अर्थात् VP1, VP2, VP3, और VP4 होते हैं. पंचक में प्रत्येक पांच गुना अक्ष encircling एक ‘कैनियन’ क्षेत्र है कि एक अवसाद के रूप में दिखाता है और रिसेप्टर बंधन3में अपनी भूमिका के लिए विख्यात है. इस घाटी के तल पर VP1 क्षेत्र है कि एक प्राकृतिक फैटी ligand नाम sphingosine (SPH) में एक हाइड्रोफोबिक जेब निहित है. सेलुलर रिसेप्टर्स, जैसे मानव P selectin ग्लाइकोप्रोटीन लिगंड 1 (PSGL-1) और scavenger रिसेप्टर वर्ग बी सदस्य 2 (SCARB2), इस ligand विस्थापित द्वारा वायरल बाइंडिंग में एक भूमिका निभाने के लिए सुझाव दिया गया है जो capsid के लिए अनुरूप परिवर्तन में परिणाम और इसके बाद , मेजबान कोशिका4,5,6में वायरल जीनोम का निष्कासन . संभावित अवरोधकों की पहचान करना जो वायरल प्रविष्टि प्रक्रिया में क्रमिक घटनाओं को अवरुद्ध करते हैं, सीवीए 16 संक्रमण के खिलाफ संभावित चिकित्सीय रणनीति प्रदान कर सकते हैं।
वायरस जीवन चक्र में कदम मोड-विशिष्ट एंटीवायरल एजेंटों की पहचान करने में मदद करने के लिए लक्ष्य के रूप में प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के माध्यम से विच्छेदन किया जा सकता है। एक समय के दवा-अतिरिक्त विश्लेषण वायरल संक्रमण के दौरान विभिन्न समय पर दवा उपचार प्रभाव की जांच, पूर्व प्रवेश सहित (वायरस संक्रमण के लिए पूर्व जोड़ा), प्रविष्टि (वायरस संक्रमण के लिए समवर्ती जोड़ा), और बाद में प्रवेश (के बाद जोड़ा वायरस संक्रमण)7| प्रत्येक उपचार स्थितियों में गठित वायरल प्लेक की संख्या की मात्रा निर्धारित करके एक मानक पट्टिका परख का उपयोग करके प्रभाव का मूल्यांकन किया जा सकता है। प्रवाह साइटोमेट्री आधारित वायरल बाइंडिंग परख निर्धारित करता है कि दवा कोशिकाओं को होस्ट करने के लिए वायरल लगाव को रोकता है। यह तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस से स्थानांतरित करके हासिल किया जाता है, जिस पर अधिकांश मानव वायरस संक्रमण होते हैं, 4 डिग्री सेल्सियस तक, जहां virions मेजबान सेल सतह से बांधने में सक्षम होते हैं लेकिन कोशिकाओं7में प्रवेश करने में असमर्थ होते हैं। कोशिका झिल्ली-बद्ध वायरस कणों को तब वायरल एंटीजन के खिलाफ इम्यूनोस्टेनिंग के माध्यम से मात्रा निर्धारित की जाती है और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मूल्यांकन किया जाता है। दूसरी ओर वायरल निष्क्रियता परख मुक्त वायरस कणों के साथ दवा की संभावित शारीरिक बातचीत का आकलन करने में मदद करता है, या तो परिरक्षण या virions तटस्थ, या समुच्चय या अनुरूप परिवर्तन है कि उन्हें निष्क्रिय के लिए प्रदान के कारण संक्रमण के दौरान मेजबान कोशिका की सतह के साथ बाद में बातचीत8,9. इस प्रयोग में, वायरल इनोकुलम को मेजबान सेल मोनोलेयर को संक्रमित करने और एक मानक पट्टिका परख8प्रदर्शन करने से पहले दवा को पतला करने से पहले दवा के साथ पहले इनक्यूबेट करने की अनुमति दी जाती है। अंत में, आणविक डॉकिंग virion सतह पर संभावित दवा बातचीत साइटों की भविष्यवाणी करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, लिफाफा वायरस से वायरल ग्लाइकोप्रोटीन और गैर-enveloped वायरस से वायरल capsid प्रोटीन सहित, कम्प्यूटेशनल का उपयोग करके एल्गोरिदम. यह मशीनी रूप से कार्रवाई की दवा के मोड के लक्ष्यों को इंगित करने में मदद करता है और उपयोगी जानकारी प्रदान करता है जिसे डाउनस्ट्रीम परख द्वारा आगे मान्य किया जा सकता है।
हमने हाल ही में एंटीवायरल यौगिकों की पहचान करने के लिए उपरोक्त विधियों का इस्तेमाल किया है जो गैर-एवेलप्ड CVA169द्वारा संक्रमण को कुशलतापूर्वक अवरुद्ध करते हैं। इसमें, विस्तृत प्रोटोकॉल है कि इस्तेमाल किया गया वर्णन और चर्चा कर रहे हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस रिपोर्ट में, हमने उन प्रोटोकॉलकां का वर्णन किया है जो एंटीवायरल उम्मीदवारों की पहचान के लिए उपयोगी हैं जो वायरल प्रविष्टि को लक्षित करते हैं, विशेष रूप से गैर-एवडील CVA16 के खिलाफ। परख वायरल प्रविष्टि ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक आणविक डॉकिंग के साथ तकनीकी सहायता के लिए ऑस्टिन में टेक्सास विश्वविद्यालय में डॉ यहोशू बेखम के लिए आभारी हैं. इस अध्ययन को आंशिक रूप से ताइवान के विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (MOST107-2320-B-037-002 से C.-J.L. और L.-T.L.) से वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था; MOST106-2320-B-038-021 और MOST107-2320-B-038-034-MY3 से L.-T.L.).
Materials
| 4% Paraformaldehyde | Sigma | AL-158127-500G | |
| Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG | Invitrogen | A11029 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| Anti-VP1 antibody | Merck-Millipore | MAB979 | Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D |
| Beckman Coulter Cytometer | Beckman Coulter | FC500 | |
| Corina | Molecular Networks GmbH | ||
| Crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | GIBCO | 11995-040 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Graphpad Prism | GraphPad | ||
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| In vitro toxicology assay kit, XTT-based | Sigma | TOX2 | |
| Methylcellulose | Sigma | M0512-100G | |
| PBS pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070-063 | |
| PyMol | Schrödinger | ||
| UCSF Chimera | University of California, San Francisco |
References
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