프로토콜의 목적은 후보 바이러스 진입 억제제를 식별하는 데 사용될 수 있는 바이러스 입력과 관련된 상이한 분석방법을 설명하는 것이다.
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방법 논문
Coxsackievirus A16에 대하여 항바이러스 후보의 확인을 위한 바이러스 성 입력 분석 및 분자 도킹 분석의 사용
이 논문에서
요약
초록
기계론적으로 바이러스 진입을 검사하는 항바이러스 분석제는 평가된 에이전트가 가장 효과적인 단계를 분별하는 것과 관련이 있으며, 후보 바이러스 진입 억제제의 식별을 허용한다. 여기서, 우리는 초기 바이러스 진입에서 바이러스 입자 또는 특정 단계를 표적으로 하여 비봉투콕사키바이러스 A16(CVA16)에 의한 감염을 차단할 수 있는 소분자의 식별을 위한 실험접근법을 제시한다. 분석법은 약물 첨가 시간 분석, 유세포분석계 바이러스 결합 분석, 및 바이러스 불활성화 분석기를 포함한다. 우리는 또한 항 바이러스 화합물에 의해 표적으로 한 잠재적인 잔류물을 예측하기 위하여 바이러스 capsid 단백질을 이용하는 분자 도킹 프로토콜을 제시합니다. 이 해법은 바이러스 성 진입에 작용하는 후보 항 바이러스 에이전트의 확인에 도움이 될 것입니다. 미래의 방향은 추가 약물 개발을 위한 이러한 가능한 억제제들을 탐구할 수 있다.
서론
손, 발 및 구강 질환(HFMD)은 어린 아이들의 콕사키바이러스 A16(CVA16) 및 엔테로바이러스 71(EV71)에 의해 가장 흔하게 발생하는 질환이다. 최근 아시아 태평양 지역에서 CVA16 유도 HFMD에 상당한 상승세가 있었습니다. 현상이 온화할 수 있는 동안, 가혹한 합병증은 잠재적인치명적인 1,2와함께 두뇌와 심혼에 영향을 미치는 생길 수 있습니다. 현재 CVA16에 사용할 수있는 허가 된 항 바이러스 요법이나 예방 접종은 없으므로 향후 발병 및 관련 합병증을 억제하기위한 항 바이러스 전략을 개발할 필요성이 절실히 필요합니다.
CVA16은 각각 VP1, VP2, VP3 및 VP4와 같은 4개의 구조 단백질을 포함하는 펜타머에서 조립된 이코사헤드랄 캡시드가 있는 비봉투 바이러스입니다. 펜타머에서 각 5 배 축을 둘러싸는 것은 우울증으로 표시하고 수용체 결합 3에서의역할로 지적되는 '협곡'영역입니다. 이 협곡의 하단에는 스핑고신(SPH)이라는 천연 지방 리간드가 들어 있는 VP1 부위에 소수성 포켓이 있습니다. 인간 P 셀렉틴 당단백질 리간드 1(PSGL-1) 및 스캐빈저 수용체 클래스 ....
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프로토콜
참고: 모든 세포 배양 및 바이러스 감염은 취급되는 견본의 생물 안전 수준에 적합한 인증된 생물 안전 성 후드에서 수행되어야 합니다. CVA16 감염을 효율적으로 차단하기 위해 관찰된 소분자 체불라그산(CHLA) 및 푸니타진(PUG)의2개의 탄닌 클래스는 후보 억제제의 예로 사용된다. 바이러스학 기술의 기본 원리, 바이러스 전파, 바이러스 적규기의 결정, 및 플라크 형성 단위(PFU) 또는 감염의 복합성(MOI)의 개념에 대해, 판독기는 참조10을참조한다.
1. 세포 배양, 바이러스 준비, 화합물 준비 및 화합물 세포 독성
- 인간 횡문근육종(RD) 세포는 CVA16감염(11)에허용되는 숙주 세포이다. D세포를 10mL의 DMEM(DMEM)으로 10% 태아 소 혈청(FBS), 200 U/mL 페니실린 G, 200 μg/mL 스트렙토마이신, 및 T-75 플라스크에서 0.5 μg/mL 암포테리신 B를 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서.
- RD 세포에서 바이러스를 전파하여 CVA16을 준비하고 PFU / mL에서 바이러스 성 적기를 결정합....
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결과
약물 첨가 시술은 도 1에 도시되어 CVA16 감염에 대한 소분자 CHLA 및 PUG를 이용한 치료로부터의 영향을 예-바이러스 입력(pre-addition) 또는 바이러스 후 진입(co-addition) 또는 후바이러스 항목( 감염 후). 두 소분자 모두 바이러스 감염 전의 숙주 세포의 전처리 여부에 관계없이 CVA16 감염에 대한 한계 영향을 발생시켰다(도1A)또는 감염 후 치료(도1C). 대조적으로, CHLA 및 PUG는 공동 첨가 처리에서 CVA16 감염을 >80%까지 효율적으로 폐지하였다(도1B). 이 관측은 그러므로 2개의 화합물이 감염 도중 호스트 세포 표면에 바이러스 입자와 동시에 존재할 때 가장 효과적이다는 것을 건의합니다.
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토론
이 보고서에서, 우리는 특히 비 포위 된 CVA16에 대하여 바이러스 입력을 표적으로 하는 항 바이러스 후보의 식별에 유용한 프로토콜을 기술했습니다. 이 실험은 바이러스 진입 중에 초기 이벤트를 해부하는 방법으로 설계되었으며, 이는 시험에이전트의 항바이러스 활성의 작용 메커니즘과 잠재적 표적(들)을 명확히 하는 데 도움이 된다. '약물 첨가 시간'은 시험 화합물의 잠재적 표적, 예를 들어 감염되지 않은 숙주 세포(전처리 분석), 바이러스 입자 또는 숙주 세포 표면과의 상호작용(공동 첨가 분석)을 광범위하게 결정할 수 있도록 허용한다. ) 또는 바이러스-감염 된 숙주 세포 바이러스 복제 단계 동안 (감염 후 분석). 이러한 분석법만으로도 본 프로토콜에 기재된 후속 분석법(예를 들어, 바이러스 불활성화 분석 및 결합 분석)을 유도하는 화합물(예를 들어, 공동 첨가)으로부터의 상호작용 방법을 결정할 수 있다. 세척 단계는 검사된 처리 방법이 분석된 치료법에 특정한지 확인하는 데 중요합니다. '유세포분석계 결합 분석'의 사용은 숙주 세.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
감사의 글
저자는 분자 도킹기술 지원을 위해 오스틴에 있는 텍사스 대학에 조슈아 베컴 박사에게 감사하고 있습니다. 이 연구는 부분적으로 대만 의 과학 기술부 (MOST107-2320-B-037-037-002에서 C.-J.L. 및 L.-T.L.에 대한 자금 지원으로 지원되었습니다. MOST106-2320-B-038-021 및 MOST107-2320-B-038-034-MY3- L.-T.L.)
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 4% 파라포름알데히드 | Sigma | AL-158127-500G | |
| Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG | Invitrogen | A11029 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| Anti-VP1 항체 | Merck-Millipore | MAB979 | Anti-Enterovirus 71 항체, Coxsackie A16, 클론 422-8D-4C-4D |
| Beckman Coulter Cytometer와 교차 반응 | 벡크만 쿨터 | FC500 | |
| Corina | Molecular Networks GmbH | ||
| 크리스탈 바이올렛 | 시그마 | C3886-100G | |
| DMEM | GIBCO | 11995-040 | |
| DMSO | 시그마 | D5879 | |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| 포름알데히드 | 시그마 | F8775 | |
| Graphpad Prism | GraphPad | ||
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| In vitro toxicology assay kit, XTT 기반 | Sigma | TOX2 | |
| 메틸셀룰로오스 | Sigma | M0512-100G | |
| PBS pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070-063 | |
| PyMol | 슈르ö dinger | ||
| UCSF 키메라 | 캘리포니아 대학교, 샌프란시스코 |
참고문헌
- Legay, F., et al. Fatal coxsackievirus A-16 pneumonitis in adult. Emerging Infectious Diseases. 13, 1084-1086 (2007).
- Wang, C. Y., Li Lu,, Wu, F., H, M., Lee, C. Y., Huang, L. M. Fatal coxsackievirus A16 infection. Pediatric Infectious Disease Journal. 23, 2....
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재인쇄 및 허가
