Beoordeling van oxidatieve schade in de primaire muis oculaire oppervlaktecellen / stamcellen in reactie op Ultraviolet-C (UV-C) Schade

Summary

Dit protocol toont de gelijktijdige detectie van reactieve zuurstofsoorten (ROS), levende cellen en dode cellen in levende primaire culturen van muisoculaire oppervlaktecellen. 2′,7′-Dichloorfluoresceindiacetaat, propidiumjodide en Hoechst-vlekken worden gebruikt om respectievelijk de ROS-, dode cellen en levende cellen te beoordelen, gevolgd door beeldvorming en analyse.

Abstract

Het oculaire oppervlak wordt onderworpen aan regelmatige slijtage als gevolg van verschillende omgevingsfactoren. Blootstelling aan UV-C-straling vormt een gevaar voor de gezondheid op het werk. Hier tonen we de blootstelling van primaire stamcellen van het oogoppervlak van de muis aan UV-C-straling. Reactieve zuurstofsoorten (ROS) vorming is de uitlezing van de omvang van oxidatieve stress / schade. In een experimentele in vitro omgeving is het ook essentieel om het percentage dode cellen te beoordelen dat wordt gegenereerd als gevolg van oxidatieve stress. In dit artikel zullen we de 2′,7′-Dichloorfluoresceindiacetaat (DCFDA) kleuring van UV-C blootgestelde muis primaire oculaire oppervlakte stamcellen en hun kwantificering op basis van de fluorescerende beelden van DCFDA vlekken. DCFDA kleuring komt direct overeen met ros generatie. We tonen ook de kwantificering van dode en levende cellen door gelijktijdige kleuring met respectievelijk propidiumjodide (PI) en Hoechst 3332 en het percentage DCFDA (ROS-positieve) en PI-positieve cellen.

Introduction

Het oculaire oppervlak (OS) is een functionele eenheid voornamelijk samengesteld uit de buitenste laag en klierepithelia van hoornvlies, lachrymale klier, meibomian klier, bindvlies, een deel van de ooglid marges en innervations die transduce signalen¹. De transparante koepelvormige hoornvlieslaag richt licht op het netvlies. Dit avasculaire weefsel bestaat uit cellulaire componenten zoals epitheelcellen, keratocyten en endotheelcellen en acellulaire componenten zoals collageen en glycosaminoglycans². Het gebied wordt afgevoerd door tranen die ook de meeste voedingsstoffen leveren. De anatomische positie van het OS dwingt het om in direct contact met de externe omgeving te zijn, vaak bloot stellen aan verschillende harde componenten zoals fel licht, microben, stofdeeltjes en chemicaliën. Deze factor predisponeert het OS voor lichamelijkletsel en maakt het gevoelig voor verschillende ziekten.

Oxidatieve stress wordt veroorzaakt door het gebrek aan evenwicht tussen de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en de endogene anti-oxidantafmechanismen³. ROS worden ingedeeld in reactieve moleculen en vrije radicalen, die beide afkomstig zijn van moleculaire zuurstof (O₂) door mitochondriale oxidatieve fosforylatie⁴. De eerste groep bestaat uit niet-radicale soorten zoals waterstofperoxide (H₂O_2),singlet zuurstof (¹O₂) en de laatste omvat soorten zoals superoxide anionen (O₂^–), en hydroxyl radicalen^(•OH), onder anderen. Deze moleculen zijn bijproducten van normale cellulaire processen en hun rollen zijn betrokken bij belangrijke fysiologische functies zoals signaaltransductie, genexpressie en hostdefense⁵. Een verbeterde productie van ROS is bekend te worden gegenereerd in reactie op factoren zoals pathogene invasie, xenobiotica, en blootstelling aan ultraviolette (UV) straling⁴. Deze overproductie van ROS resulteert in oxidatieve stress die leidt tot de schade van moleculen zoals nucleïnezuren, eiwitten en lipiden⁶.

Natuurlijk zonlicht, de meest overheersende bron van UV-straling, bestaat uit UV-A (400-320 nm), UV-B (320-290 nm) en UV-C (290-200 nm)⁷. Een omgekeerde correlatie tussen de golflengte en spectrale energieën is gemeld. Hoewel natuurlijke UV-C-straling door de atmosfeer wordt geabsorbeerd, stoten kunstmatige bronnen zoals kwiklampen en lasinstrumenten uit en vormen daarom een beroepsrisico. Symptomen van blootstelling aan de ogen zijn fotokeratitis en photokeratoconjunctivitis⁸. Productie van ROS is een van de belangrijkste mechanismen van het toebrengen van UV-geïnduceerde cellulaire schade⁹. In de huidige studie tonen we de detectie van ROS aan met behulp van de 2′,7′-Dichloordihydrofluorescelaat (DCFDA) kleuringsmethode in de primaire oculaire oppervlaktecellen/stamcellen van de muis die zijn blootgesteld aan UV-C. De groene fluorescentie werd vastgelegd met behulp van fluorescerende microscopie. Cellen werden tegengekleurd met twee kleurstoffen, Hoechst 33342 en rode propidiumjodide, om de levende en dode cellen te bevlekken, respectievelijk.

Protocol

Het experiment werd uitgevoerd op primaire oculaire cellen/ stamcellen afgeleid van het Zwitserse albino muisoog. Het gebruik van dieren voor het oogsten van de ogen voor dit experiment werd goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor het ethisch onderzoek van dieren, Yenepoya (geacht universiteit) (IEAC-goedkeuringsnummer, 6a/19.10.2016). 1. Voorbereidingen van reagentia OPMERKING: De afleiding van primaire cellen/stamcellen van het oogoppervlak van de muis valt…

Representative Results

DCFDA is een kleurloze kleurstof die een chemisch gereduceerde vorm van fluorescein gebruikt als een indicator voor het opsporen van ROS in cellen. Deze kleurstof wordt gevangen in cellen en is gemakkelijk geoxideerd tot fluorescerende dichloordihydrofluoresceine (DCF), die een groene fluorescentie uitzendt. Deze fluorescentie kan worden gedetecteerd met behulp van fluorescerende microscopie. De cellen kunnen als volgt worden gevisualiseerd en gecorreleerd met ROS-accumulatie: i) levende cellen zonder ROS zenden hoge bla…

Discussion

De DCFDA kleuring methode hier beschreven maakt de visualisatie van ROS in de muis primaire oculaire levende cellen behandeld met UV-C straling. Een voordeel van deze kleuringsmethode is dat het ook de onderzoekers in staat stelt om de onmiddellijke effecten van UV-C (3 uur na UVC-blootstelling) op de levende cellen en hun gelijktijdige opsomming voor het percentage ROS-positieve, evenals dode cellen te bestuderen. Bovendien, als de kleuring methode wordt gebruikt op de levende cellen, kunnen de cellen verder worden geï…

Materials

2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA)	Sigma	D6883	2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species.
Cell culture dish (35 mm)	Eppendorf	SA 003700112	Sterile dishes for culturing the cells.
DMEM High Glucose	HiMedia	AT007	Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose.
Fetal Bovine Serum, EU Origin	HiMedia	RM99955	One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements.
GlutMax	Gibco, Thermo Fisher Scientific	35050061	Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth.
HL-2000 Hybrilinker	UVP		Hybridization oven/UV cross linker
Hoechst 33342	Sigma	B2261	Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive.
Matrigel	Corning		Basement membrane matrix
MEM Non-Essential Amino Acids (100X)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	11140050	Used as a supplement to increase the cell growth and viability.
Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15140122	Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture.
Propidium Iodide	Sigma	P4170	Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells.
TryplE Express	Thermo Fisher Scientific		Gentle cell dissociation agent
ZOE Fluorescent Cell Imager	Bio-rad