Ultraviyole-C (UV-C) Hasarına Yanıt Olarak Birincil Fare Oküler Yüzey Hücrelerinde/Kök Hücrelerinde Oksidatif Hasarın Değerlendirilmesi
Summary
Bu protokol, fare oküler yüzey hücrelerinden canlı birincil kültürlerde reaktif oksijen türlerinin (ROS), canlı hücrelerin ve ölü hücrelerin eşzamanlı olarak tespitini göstermektedir. 2′,7′-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iyodür ve Hoechst boyama ros, ölü hücreleri ve canlı hücreleri değerlendirmek için kullanılır, sırasıyla, görüntüleme ve analiz izledi.
Abstract
Oküler yüzey çeşitli çevresel faktörler nedeniyle düzenli aşınma ve yıpranmaya maruz kılmaktadır. UV-C radyasyonuna maruz kalmak iş sağlığı açısından tehlike oluşturur. Burada, fare oküler yüzeyinden UV-C radyasyonuna birincil kök hücrelerin maruz kalma gösteriş. Reaktif oksijen türleri (ROS) oluşumu oksidatif stres/hasar ın derecelerinin okunmasıdır. Deneysel bir in vitro ayarda, oksidatif stres nedeniyle oluşan ölü hücrelerin yüzdesini değerlendirmek de gereklidir. Bu yazıda, UV-C maruz kalan fare primer oküler yüzey kök hücrelerinin 2′,,7′-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) boyama ve dcfda boyama floresan görüntüleridayalı bunların nicelliği gösterecektir. DCFDA boyama doğrudan ROS üretimine karşılık gelir. Ayrıca sırasıyla propidium iyodür (PI) ve Hoechst 3332 ile eşzamanlı boyama ve DCFDA (ROS pozitif) ve PI pozitif hücrelerin yüzdesi ile ölü ve canlı hücrelerin sayısallaştırılmasını gösteriyoruz.
Introduction
Göz yüzeyi (OS) fonksiyonel bir birim ağırlıklı olarak dış tabaka ve kornea glandüler epitel oluşan, lachrymal bezi, meibomian bezi, konjonktiva, göz kapağı marjları ve innervasyonları bir parçası bu transduce sinyalleri1. Şeffaf kubbe şeklindeki kornea tabakası retinaüzerine ışık odaklanır. Bu avasküler doku epitel hücreleri, keratositler ve endotel hücreleri ve kollajen ve glikozaminoglikanlar 2 gibi hücresel bileşenler gibi hücresel bileşenlerden oluşur2. Alan da besinlerin çoğunu kaynağı gözyaşları tarafından boşaltılır. İşletim sistemi anatomik konumu genellikle parlak ışık, mikroplar, toz parçacıkları ve kimyasallar gibi çeşitli sert bileşenlere maruz, dış çevre ile doğrudan temas olması için zorlar. Bu faktör işletim sistemi fiziksel yaralanmalara yatkındır ve çeşitli hastalıklara yatkın hale getirir.
Oksidatif stres reaktif oksijen türlerinin üretimi arasındaki dengesizlik nedeniyle kaynaklanır (ROS) ve endojen antioksidan savunma mekanizmaları3. ROS, moleküler oksijenden (O2)mitokondriyal oksidatif fosforilasyon4ile elde edilen reaktif moleküller ve serbest radikaller olarak sınıflandırılır. Eski grup hidrojen peroksit (H2O2),singlet oksijen (1O2) gibi radikal olmayan türlerden oluşur ve ikincisi süperoksit anyonlar (O2–), ve hidroksil radikalleri(•OH) gibi türleri içerir. Bu moleküller normal hücresel süreçlerin yan ürünleridir ve rolleri sinyal transdüksiyonu, gen ekspresyonu ve konaksavunması5 gibi önemli fizyolojik fonksiyonlarda rollenmiştir. Ros gelişmiş bir üretim patojen invazyonu, ksizbiyotikler ve ultraviyole maruz kalma gibi faktörlere yanıt olarak üretildiği bilinmektedir 4. ROS’un bu aşırı üretimi, nükleik asitler, proteinler velipidler6 gibi moleküllerin zarar görmesine yol açan oksidatif strese yol açar.
Doğal güneş ışığı, UV radyasyonunun en baskın kaynağı, UV-A (400-320 nm), UV-B (320-290 nm) ve UV-C (290-200 nm)7oluşur. Dalga boyu ve spektral enerjiler arasında ters bir korelasyon bildirilmiştir. Doğal UV-C ışınları atmosfer tarafından emilir rağmen, cıva lambaları ve kaynak aletleri gibi yapay kaynaklar yayarlar ve bu nedenle, bir mesleki tehlike oluşturmaktadır. Gözlere maruz kalma belirtileri fotokeratit ve fotokeratokonjonktivit8içerir. ROS üretimi UV kaynaklı hücresel hasar inflicting önemli mekanizmalardan biridir9. Mevcut çalışmada, UV-C’ye maruz kalan fare primer oküler yüzey hücrelerinde/kök hücrelerinde 2′,7′-Diklorodihidrofloresesein diasetat (DCFDA) boyama yöntemi kullanılarak ROS saptanması gösterilmiştir. Yeşil floresan floresan mikroskopi ile yakalandı. Hücreler, canlı ve ölü hücreleri lekelemek için iki boya, Hoechst 33342 ve kırmızı propidium iyodür ile karşı lekeli idi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan DCFDA boyama yöntemi, UV-C radyasyonu ile tedavi edilen fare primer göz canlı hücrelerinde ROS’un görüntülenmesine olanak sağlar. Bu boyama yönteminin bir avantajı da araştırmacılar UV-C hemen etkilerini incelemek için izin olmasıdır (3 saat uvc sonrası maruz kalma) canlı hücreler ve ROS pozitif yüzdesi için eşzamanlı numaralandırma, yanı sıra, ölü hücreler. Ayrıca, boyama yöntemi canlı hücreler üzerinde kullanıldığından, hücreler UV-C radyasyonunun gecikmiş etki…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, altyapı tesisleri için Yenepoya Araştırma Merkezi, Yenepoya (Üniversite olarak kabul edilir) desteği kabul.
Materials
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA) | Sigma | D6883 | 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species. |
| Cell culture dish (35 mm) | Eppendorf | SA 003700112 | Sterile dishes for culturing the cells. |
| DMEM High Glucose | HiMedia | AT007 | Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose. |
| Fetal Bovine Serum, EU Origin | HiMedia | RM99955 | One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements. |
| GlutMax | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth. |
| HL-2000 Hybrilinker | UVP | Hybridization oven/UV cross linker | |
| Hoechst 33342 | Sigma | B2261 | Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive. |
| Matrigel | Corning | Basement membrane matrix | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100X) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Used as a supplement to increase the cell growth and viability. |
| Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture. |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170 | Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells. |
| TryplE Express | Thermo Fisher Scientific | Gentle cell dissociation agent | |
| ZOE Fluorescent Cell Imager | Bio-rad |
References
- Gipson, I. K. The ocular surface: the challenge to enable and protect vision: the Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).
- Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmoogy. 66 (2), 190-194 (2018).
- Betteridge, D. J. What is oxidative stress. Metabolism. 49 (2), 3-8 (2000).
- Ray, P. D., Huang, B. W., Tsuji, Y. Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling. Cell Signaling. 24 (5), 981-990 (2012).
- Nita, M., Grzybowski, A. The Role of the Reactive Oxygen Species and Oxidative Stress in the Pathomechanism of the Age-Related Ocular Diseases and Other Pathologies of the Anterior and Posterior Eye Segments in Adults. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3164734 (2016).
- Covarrubias, L., Hernandez-Garcia, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregon, S. Function of reactive oxygen species during animal development: passive or active. Developmental Biology. 320 (1), 1-11 (2008).
- Behar-Cohen, F., et al. Ultraviolet damage to the eye revisited: eye-sun protection factor (E-SPF(R)), a new ultraviolet protection label for eyewear. Clinical Ophthalmology. 8, 87-104 (2014).
- Izadi, M., Jonaidi-Jafari, N., Pourazizi, M., Alemzadeh-Ansari, M. H., Hoseinpourfard, M. J. Photokeratitis induced by ultraviolet radiation in travelers: A major health problem. Journal of Postgraduate Medicine. 64 (1), 40-46 (2018).
- de Jager, T. L., Cockrell, A. E., Du Plessis, S. S. Ultraviolet Light Induced Generation of Reactive Oxygen Species. Advances in Experimental Medicine and Biology. 996, 15-23 (2017).
- Degl’Innocenti, D., et al. Oxadiazon affects the expression and activity of aldehyde dehydrogenase and acylphosphatase in human striatal precursor cells: A possible role in neurotoxicity. Toxicology. 411, 110-121 (2019).
- Li, Z., et al. APC-Cdh1 Regulates Neuronal Apoptosis Through Modulating Glycolysis and Pentose-Phosphate Pathway After Oxygen-Glucose Deprivation and Reperfusion. Cellular and Molecular Neurobiology. 39, 123-135 (2019).
