NMR-baserte aktivitet analyser for å bestemme sammensatte hemming, IC50 verdier, Artifactual aktivitet, og hele cellen aktivitet av nukleosid Ribohydrolases

Summary

NMR-baserte aktivitets analyser er utviklet for å identifisere og karakterisere hemmere av to nukleosid ribohydrolase enzymer. Protokoller er gitt for innledende sammensatte analyser på 500 μM og 250 μM, dose-respons analyser for fastsettelse av IC₅₀ verdier, vaskemiddel Counter skjerm analyser, Jump-fortynning Counter skjerm analyser, og analyser i E. coli hele celler.

Abstract

NMR spektroskopi brukes ofte for identifisering og karakterisering av enzym hemmere i stoffet funnet, spesielt i sammenheng med fragment screening. NMR-baserte aktivitet analysene er ideelt egnet til å arbeide på høyere konsentrasjoner av test forbindelser som kreves for å oppdage disse svakere hemmere. Den dynamiske rekkevidden og kjemisk forskyvning dispersjon i et NMR eksperiment kan lett løse resonanser fra substrat, produkt, og test forbindelser. Dette står i kontrast til Spektrofotometriske analyser, der problemer med lese forstyrrelser ofte oppstår fra forbindelser med overlappende UV-Vis absorpsjons profiler. I tillegg, siden de mangler reporter enzymer, enkelt-enzym NMR analysene er ikke utsatt for koblet-analysen falske positiver. Dette attributtet gjør dem nyttige som ortogonale analyser, og supplerer tradisjonelle høy gjennomstrømming screening analyser og stasjonære sortering analyser. Detaljerte protokoller er gitt for innledende sammensatte analyser på 500 μM og 250 μM, dose-respons analyser for å bestemme IC₅₀ verdier, vaskemiddel Counter skjerm analyser, Jump-fortynning Counter skjerm analyser, og analyser i E. coli hele celler. Metodene er demonstrert ved hjelp av to nukleosid ribohydrolase enzymer. Bruken av ¹H NMR er vist for det purine-spesifikke enzymet, mens ¹⁹F NMR er vist for det pyrimidin-spesifikke enzymet. Protokollene er vanligvis gjelder for alle enzym der substrat og produkt resonanser kan observeres og skilles av NMR spektroskopi. For å være den mest nyttige i sammenheng med stoffet funnet, bør den endelige konsentrasjonen av underlaget ikke være mer enn 2-3x sin K_m verdi. Valget av NMR eksperiment avhenger av enzymet reaksjon og underlag tilgjengelig samt tilgjengelig NMR instrumentering.

Introduction

Kjernefysisk magnetisk resonans (NMR) spektroskopi er godt etablert for karakteriserer og overvåking enzymreaksjoner^1,2. Forskjeller i kjemiske Skift og koblings mønstre brukes til å skille substrat og produkt resonanser, og relativ resonans intensitet brukes til å kvantifisere prosent av reaksjonen. Både forbruk av substrat og etablering av produktet er direkte observert i NMR spektrum. Dette kontraster med Spektrofotometri eller fluorescens spektroskopi, der reaksjonstiden kurset er indikert av en endring i absorbansen tilskrives noen kjemiske arter blir konsumert eller opprettet. Akkurat som med de andre metodene, kan NMR brukes til å studere enzymreaksjoner som en funksjon av temperatur, pH, eller andre løsnings betingelser, og effekten av hemmere kan bestemmes.

Mer nylig har NMR-baserte enzym aktivitet analyser blitt demonstrert for fragment screening^3,4. NMR-baserte analyser er ideelt egnet til å arbeide ved høyere konsentrasjoner av test forbindelser (ofte så høyt som 1 mM) som kreves for å oppdage disse svakere hemmere. Den dynamiske rekkevidden og kjemisk forskyvning dispersjon i NMR eksperimentet kan enkelt løse resonanser fra substrat, produkt, og test forbindelser. Dette sammenligner gunstig til Spektrofotometriske analyser der lese forstyrrelser problemer ofte oppstår fra forbindelser med overlappende UV-Vis absorpsjon profiler. I tillegg, siden de mangler reporter enzymer, enkelt-enzym NMR analysene er ikke utsatt for koblet-analysen falske positiver. Denne fordelen gjør dem nyttige som ortogonale analyser, supplerer tradisjonell høy gjennomstrømming screening analyser og stasjonære sortering analyser⁵.

I vårt forskningslaboratorium brukes NMR-baserte aktivitets analyser til å identifisere og evaluere hemmere av trichomonas vaginalis nukleosid ribohydrolases. T. vaginalis parasitten forårsaker de mest utbredte ikke-viral seksuelt overførbare sykdommer⁶. Økende motstand mot eksisterende terapier⁷ kjører behovet for romanen, mekanisme-baserte behandlinger, med essensielle nukleosid berging Pathway enzymer som representerer Prime mål⁸. NMR-baserte aktivitet analyser er utviklet for både pyrimidin-og purine-spesifikke enzymer, uridindifosfatglukuronosyltransferase nukleosid ribohydrolase (UNH)⁹, og adenosin/guanosin foretrakk nukleosid RIBOHYDROLASE (AGNH)¹⁰. Reaksjonene som katalysert av disse to enzymene er vist i figur 1. NMR-analysene brukes til å skjerm fragment biblioteker for kjemiske startpunkter, bestemme IC₅₀ -verdier og Luke ut aggregering-baserte eller kovalente binding hemmere¹¹. De samme analysene blir også oversatt for å vurdere enzym aktivitet i hele celler¹².

Detaljerte protokoller er gitt for innledende sammensatte analyser på 500 μM og 250 μM, dose-respons analyser for å bestemme IC₅₀ verdier, vaskemiddel Counter skjerm analyser, Jump-fortynning Counter skjerm analyser, og analyser i E. coli hele celler. Protokollene er generelt gjelder for alle enzym der substrat og produkt resonanser kan observeres og skilles av NMR spektroskopi. Tre forutsetninger har blitt gjort for enkelhet. Først er underlaget ikke spesifisert. For at NMR-baserte aktivitets analyser skal være nyttige, bør den endelige konsentrasjonen av underlaget ikke være mer enn 2-3x K_m verdi⁴. I eksemplene som vises, er de endelige konsentrasjonene av adenosin og 5-fluorouridine 100 μM (k_m = 54 μM) og 50 μm (k_m = 15 μM), henholdsvis. I protokollene, som oppnår disse konsentrasjonene tilsvarer 12 μL av 5 mM adenosin eller 12 μL av 2,5 mM 5-fluorouridine.

For det andre, mengden av enzymet fastsatt i protokollene, 5 μL, ble valgt til å tilsvare det beløpet som kreves for å resultere i ca 75% konvertering av substrat til produktet i 30 min. Dette antallet representerer vanligvis en stor fortynning fra et renset enzym lager, og fortynning må fastsettes på forhånd for hvert enzym. Renset AGNH og UNH enzym lager løsninger er lagret ved-80 ° c i alikvoter som gir nok enzym for flere tusen reaksjoner. Således, det fortynning faktoren ideal bare nødvendig å bli besluttet eller godkjent enhver få måneder. For det tredje er ikke det spesifikke 1D NMR-eksperimentet angitt. I de representative resultatene vises ¹H NMR for AGNH¹⁰ og ¹⁹F NMR vises for UNH⁹, med det NMR eksperimentet som er beskrevet i de tilsvarende referansene. Valget av NMR eksperiment avhenger av enzymet reaksjon og underlag tilgjengelig samt tilgjengelig NMR instrumentering. Til slutt bør det være påpekt at den eksperimentelle tilnærmingen beskrevet ikke overholder de strenge kravene til kvantitative NMR (qNMR)^13,14. I protokollen bestemmes en prosent reaksjon ved hjelp av de relative endringene i intensiteten av den samme resonans i hvert spektrum, i stedet for ved å bestemme absolutte konsentrasjoner. Denne tilnærmingen eliminerer behovet for innhenting av data og behandling av modifikasjoner i tillegg til interne eller eksterne standarder, som kreves for qNMR.

Protocol

1. innledende test sammensatte analyser ved 500 μM og 250 μM Forbered substrat og test sammensatte for reaksjoner. Forbered lager løsninger av substrat (adenosin eller 5-fluorouridine) i vann og 50 mM test sammensatte i deuterert dimethyl sulfoxide (DMSO). Se Introduksjons seksjonen for konsentrasjoner av substrat løsning å bruke. Tilsett 12 μL av substrat (adenosin eller 5-fluorouridine) til hver av de fire 1,5 mL microfuge rørene, 1 – 4. Tilsett 6 μL av deuterert DMSO t…

Representative Results

Figur 2 viser resultatene for testing av to FORBINDELSER mot AGNH med 1H NMR etter avsnitt 1. Enzymet reaksjonen er lettest observert og kvantifisert av forsvinningen av adenosin singlet og doublet resonanser ved 8,48 ppm og 6,09 ppm, henholdsvis, og utseendet av en adenine singlet resonans på 8,33 ppm som observert i 30 min kontroll Spekteret. I nærvær av 500 μM sammensatte 1, er ingen produkt dannet som dokumentert av mangelen på en adenine resonans på 8,33 ppm. I nærvær…

Discussion

Protokollene beskrevet er generelt gjelder for mange enzymer, forutsatt at underlag og/eller produkter har kan løses signaler i NMR spektrum. Det er imidlertid avgjørende at konsentrasjonen av underlaget er nær sin K_m verdi og høy nok til å bli oppdaget i et NMR eksperiment innen rimelig tidsramme. Et substrat konsentrasjon ikke høyere enn 2-3x K_m -verdien er optimal for påvisning av konkurrerende, nonkompetitiv og utkonkurrert hemmere⁴. Som vist her …

Materials

AGNH	Purified in-house	N/A	TVAG_213720
UNH	Purified in-house	N/A	TVAG_092730
Adenosine	Sigma	A9251
5-Fluorouridine	Sigma	F5130
Dimethyl sulfoxide-D6	Cambridge Isotope Labs	DLM-10-100	D, 99.9%
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P0662
Potassium phosphate dibasic	Sigma	P3786
Potassium chloride	Sigma	P9541
Deuterium oxide	Cambridge Isotope Labs	DLM-4-100	D, 99.9%
Hydrochloric acid	Fisher Chemical	A144212
Triton X-100	Sigma	X100
3-(Trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3,-d4 acid sodium salt (TSP)	Sigma	269913	D, 98%
2,2,2-Trifluoroethanol-1,1-d2	Sigma	612197	D, 99.5%
Pipette	Gilson	F123602	PIPETMAN Classic P1000
Pipette	Gilson	F123601	PIPETMAN Classic P200
Pipette	Gilson	F123600	PIPETMAN Classic P20
Microfuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
Conical tubes	Corning	352099
Microcentrifuge	Eppendorf	5418
Vortex mixer	Fisher Scientific	02215365
NMR tubes	Norell	502-7	Or as appropriate for the NMR
NMR spectrometer	Bruker	N/A	AvanceIII500
Prism software	GraphPad	N/A	Version 5.04