Preparazione del campione per la spettrometria di massa di ionizzazione elettrospray sonda

Summary

Questo articolo introduce metodi di preparazione di esempio per un metodo analitico unico in tempo reale basato sulla spettrometria di massa ambientale. Questo metodo ci permette di eseguire analisi in tempo reale delle molecole biologiche in vivo senza particolari pretrattamenti.

Abstract

La spettrometria di massa (MS) è un potente strumento nella chimica analitica perché fornisce informazioni molto accurate sulle molecole, come i rapporti massa-carica (m/z), utili per dedurre pesi e strutture molecolari. Mentre è essenzialmente un metodo analitico distruttivo, recenti progressi nella tecnica di ionizzazione ambientale ci hanno permesso di acquisire dati lasciando il tessuto in uno stato relativamente intatto in termini di integrità. La ionizzazione dell’elettrospray a sonda (PESI) è un cosiddetto metodo diretto perché non richiede un pretrattamento complesso e dispendioso in termini di tempo dei campioni. Un ago sottile funge da raccoglitore campione, nonché come emettitore di ionizzazione. Sulla base della proprietà molto nitida e fine della punta della sonda, la distruzione dei campioni è minima, permettendoci di acquisire le informazioni molecolari in tempo reale da esseri viventi in situ. Qui, introduciamo tre applicazioni della tecnica PESI-MS che saranno utili per la ricerca e lo sviluppo biomedico. Uno riguarda l’applicazione al tessuto solido, che è l’applicazione di base di questa tecnica per la diagnosi medica. Poiché questa tecnica richiede solo 10 mg del campione, può essere molto utile nelle impostazioni cliniche di routine. La seconda applicazione è per la diagnostica medica in vitro in cui viene misurato il siero del sangue umano. La capacità di misurare campioni di liquidi è preziosa anche in vari esperimenti biologici in cui non è possibile fornire un volume sufficiente di campione per le tecniche analitiche convenzionali. La terza applicazione si appoggia verso l’applicazione diretta di aghi sonda in animali viventi, dove possiamo ottenere la dinamica in tempo reale di metaboliti o farmaci in organi specifici. In ogni applicazione, possiamo dedurre le molecole che sono state rilevate dalla SM o utilizzare l’intelligenza artificiale per ottenere una diagnosi medica.

Introduction

La spettrometria di massa (MS) è una realizzazione tecnologica del riduzionismo; riduce l’oggetto dell’analisi a un’unità che può essere interpretata sulla base di specie molecolari o cascate. Pertanto, è un metodo rappresentativo di chimica analitica. È costituito da quattro processi: ionizzazione, analisi, rilevamento e acquisizione spettrale. Poiché la ionizzazione della molecola è il primo processo nella spettrometria di massa, generalmente limita la forma degli analiti da elaborare. La maggior parte delle procedure di ionizzazione richiedono la distruzione della struttura, della morfologia e dei processi biologici in tempo reale di campioni organici. Ad esempio, la ionizzazione dell’elettrospray (ESI) MS richiede che i campioni siano in uno stato liquido per una ionizzazione efficiente¹. I campioni, quindi, devono passare attraverso una complessa preparazione biochimica, che altera la composizione delle molecole. In alternativa, mentre la SM per la desorptizione laser assistita da matrice può ricostruire mappe molecolari del tessuto sezionato^sottile2,3, la sua efficienza di ionizzazione è troppo bassa per rilevare tutte le molecole nei campioni ed è particolarmente scarsa nell’analisi degli acidi grassi. Considerando queste limitazioni, la ionizzazione dell’elettrospray a sonda (PESI)⁴ può essere utilizzata per osservare i cambiamenti in tempo reale nei sistemi biologici in situ senza distruggere l’integrità strutturale⁵, mentre l’organismo biologico osservato è tecnicamente in uno stato vivente. In questo caso viene utilizzato un ago molto fine che funge simultaneamente da raccoglitore di campioni e come emettitore di ioni. Ciò significa che le complesse sequenze di pretrattamento del campione possono essere bypassate per ottenere spettri di massa che riflettano i componenti molecolari del sistema vivente in situ.

Ci sono diversi altri metodi di ionizzazione che rivaleggiano con PESI-MS. Uno è la spettrometria di massa evaporativa rapida evaporativa (REIMS)⁶. Questa tecnica funziona bene durante l’intervento chirurgico perché è assemblato con un coltello elettrico e raccoglie il pennacchio di ioni generato durante l’incisione. Mentre REIMS è molto utile per l’intervento chirurgico, è essenzialmente un metodo distruttivo che richiede l’ablazione elettrica del tessuto. Pertanto, non è utile per l’analisi dettagliata di cellule e tessuti in un campione preparativo o in analisi di laboratorio. Inoltre, poiché raccoglie una grande quantità di pennacchio contenente detriti tissutali, richiede una lunga manutenzione dei dispositivi dopo ogni utilizzo, limitando così l’uso di questa macchina a procedure chirurgiche speciali. Un metodo simile, chiamato spettrometria di massa di desorption laser desorption (LDI-MS)⁷, è un’altra tecnica che non è invasiva e utile per l’analisi della superficie. Poiché questa tecnica è efficace nella scansione della superficie di un campione, ottiene un’analisi bidimensionale completa come la spettrometria di massa di imaging MALDI^8,9. Tuttavia, poiché LDI-MS è applicabile solo all’analisi della superficie, IL PESI-MS è vantaggioso per l’analisi dei campioni, ad esempio all’interno del tessuto. Un’altra tecnica, la MasSpec Pen¹⁰, è stata segnalata per ottenere un’elevata specificità e sensibilità nella diagnosi del cancro della tiroide, ma il diametro della sonda è nell’ordine di mm ed è specifico per l’analisi della superficie, il che significa che non è in grado di rilevare piccoli noduli di cancro o lesioni profondamente localizzate. Inoltre, poiché questo metodo utilizza un canale di flusso microcapillare incorporato nella penna della sonda, la contaminazione incrociata deve essere presa in considerazione, in modo simile a LDI-MS. Esistono altre tecniche che sono state applicate a impostazioni cliniche, come la sonda di flusso e il modulo di ionizzazione tamponato¹¹, ma non sono diffusi.

IL PESI è la miniaturizzazione estrema dell’ESI, in cui il capillare del nano-elettrospray converge su un ago solido con un raggio di curvatura della punta di diverse centinaia di nm. La ionizzazione avviene nell’area estremamente ristretta della punta dell’ago formando un cono Taylor, su cui rimangono campioni fino a quando la ionizzazione di tutto il fluido sulla punta è completata¹². Se l’analita rimane sulla punta dell’ago metallico, la carica in eccesso viene continuamente generata all’interfaccia tra l’ago metallico e gli analiti. Pertanto, la ionizzazione sequenziale delle molecole si verifica a seconda della loro attività superficiale. Questa proprietà rende l’ago punta una sorta di cromatogramma, separando gli analiti a seconda della loro attività superficiale. Più tecnicamente, le molecole con l’attività superficiale più forte arrivano alla superficie del cono Taylor e vengono ionizzate prima di quelle con un’attività superficiale più debole, che aderiscono alla superficie dell’ago fino alla fine del processo di ionizzazione. Così, la ionizzazione completa di tutte le molecole raccolte dall’ago è raggiunto¹³. Inoltre, poiché questa tecnica non comporta l’aggiunta di solvente superfluo al campione, diverse centinaia di femtolitri sono sufficienti per ottenere spettri di massa abbastanza forti per ulteriori analisi¹⁴. Queste proprietà sono vantaggiose per l’analisi di campioni biologici intatti. Tuttavia, uno svantaggio maggiore dell’AMM risiede nella discontinuità nella ionizzazione a causa del movimento reciproco dell’ago lungo l’asse verticale, simile a una macchina di segatura. La ionizzazione avviene solo quando la punta della sonda raggiunge il punto più alto quando l’altezza dell’orifizio io. La ionizzazione cessa mentre l’ago raccoglie i campioni, e quindi la stabilità della ionizzazione non è uguale a quella nell’ESI convenzionale. Pertanto, IL PESI-MS non è un metodo ideale per la proteomica.

Ad oggi, IL PESI-MS è stato applicato principalmente all’analisi dei sistemi biologici, coprendo un’ampia gamma di campi, dalla ricerca di base agli ambienti clinici. Ad esempio, l’analisi diretta del tessuto umano preparato durante l’intervento è stato in grado di rivelare l’accumulo di triacylglycerolo sia nel carcinoma a cellule renali¹⁵ che nel carcinoma squamoso pharyeal¹⁶. Questo metodo può anche misurare campioni liquidi, come il sangue, per concentrarsi sul profilo lipidico. Ad esempio, alcune molecole sono state delineate durante i cambiamenti dietetici nei conigli; è stato riferito che alcune di queste molecole sono diminuite nelle fasi molto iniziali degli esperimenti, indicando l’elevata sensibilità e utilità di questo sistema per la diagnosi clinica¹⁷. Inoltre, l’applicazione diretta ad un animale vivente ha permesso la rilevazione di cambiamenti biochimici del fegato dopo appena una notte di digiuno⁵. Questo esperimento 5 ha^rivisitato questo esperimento⁵ e ha analizzato i profili metabolici del fegato quasi allo stesso modo, con risultati che hanno rafforzato la stabilità e la riproducibilità del nostro metodo originale. Inoltre, siamo stati in grado di discriminare il tessuto tumorale dal fegato non canceroso circostante nei topi utilizzando questa tecnica¹⁹. Pertanto, si tratta di una tecnica di spettrometria di massa versatile che è utile in vari ambienti, sia in vivo che in vitro. Da un altro punto di vista, il modulo può essere realizzato per adattarsi a vari spettrometri di massa regolando l’attacco di montaggio PESI. In questo breve articolo vengono presentate le nozioni di base e gli esempi di applicazioni (Figura 1), incluse le applicazioni con animali viventi⁵.

Secondo i regolamenti e le leggi di ciascun paese, parti di questo protocollo dovranno essere riviste per soddisfare i criteri di ciascuna istituzione. L’applicazione all’organismo vivente è la più interessante e stimolante perché può fornire cambiamenti biochimici o metabolici nei tessuti o negli organi negli animali viventi in situ. Mentre questa domanda è stata approvata dal comitato istituzionale per la cura degli animali presso l’Università di Yamanashi, nel 2013⁵, un altro ciclo di approvazione sarà ora necessario a causa dei recenti cambiamenti nelle normative per gli esperimenti sugli animali. Sono pertanto consigliabili apportare diverse modifiche al regime sperimentale. Per quanto riguarda gli spettri di massa ottenuti negli esperimenti, tenendo conto delle fluttuazioni degli spettri di massa tra ogni misurazione, non esiste un sistema di condivisione delle informazioni spettrali comune alla comunità di sequenziamento dei nucleotidi. La cura deve essere presa quando l’operatore gestisce l’ago per evitare incidenti aghi, soprattutto quando si rimuove l’ago dal supporto dell’ago. Un dispositivo speciale per staccare l’ago è molto utile per questo scopo. Poiché il compartimento del modulo PESI è ermetico, la perdita del pennacchio ionica non si verifica se lo spettrometro di massa viene azionato secondo le istruzioni.

Protocol

Il comitato istituzionale per la cura degli animali dell’Università di Yamanashi ha approvato tutti i protocolli e l’uso di animali sperimentali indicati nel presente documento. L’utilizzo del campione umano è stato approvato dal comitato etico istituzionale dell’Università di Yamanashi. 1. Preparazione del tessuto solido NOTA: I campioni devono essere tenuti sul ghiaccio dopo la loro rimozione dal corpo animale o umano per preservare la freschezza del tessuto. Se …

Representative Results

Come illustrato nella Figura 3, i dati ottenuti dalla tecnica DEI PESI-MS sono gli spettri di massa, la cui gamma m/z va da 10 a 1.200 in questo sistema. Mentre si possono rilevare molecole fino a m/z 2.000, ci sono stati pochi picchi ottenuti utilizzando questa tecnica sulla gamma di massa di m/z 1.200. Pertanto, abbiamo analizzato picchi da m/z 10 a 1.200. C’erano gruppi cospicui di picchi intorno m/z 800 e 900; …

Discussion

Anche se PESI è un derivato di ESI per la spettrometria di massa⁴, è più vantaggioso per il monitoraggio della metabolomica in tempo reale, così come per l’analisi delle reazioni biochimiche senza eseguire alcun pretrattamento complesso o dispendioso in termini di tempo^5,14,15,17. È una tecnica di spettrometria di massa facile e istantanea che può essere applicata …

Materials

5-Fluoro-2'-deoxyuridine (5-FdU)	Sigma-Aldrich	F8791-25MG	25mg
disposable biposy punch (Trepan)	kai Europa GmbH	BP-30F	bore size 3mm
ethanol	nacalai tesque	14710-25	extra pure reagent
LabSolutions	Shimadzu		ver. 5.96, Data analyzer
micropestle	United Scientific Supplies	S13091
microtube	Treff	982855	0.5 mL clear
PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS)	Shimadzu	DPiMS-2020	Mass spectrometer equipped with PESI
PPGT solition	Shimadzu	ND	Attached to DPiMS-2020