Prøve forberedelse til sonde elektrospray ionisering massespektrometri

Summary

Denne artikkelen introduserer eksempelforberedelsesmetoder for en unik sanntidsanalytisk metode basert på omgivelsesmassespektrometriet. Denne metoden lar oss utføre sanntidsanalyse av de biologiske molekylene in vivo uten spesielle forbehandlinger.

Abstract

Massespektrometri (MS) er et kraftig verktøy i analytisk kjemi fordi det gir svært nøyaktig informasjon om molekyler, for eksempel masse-til-lade-forhold (m / z), som er nyttige for å utlede molekylvekter og strukturer. Selv om det i hovedsak er en destruktiv analytisk metode, har nylige fremskritt i omgivelsesteknikken gjort oss i stand til å skaffe data samtidig som vev i relativt intakt tilstand når det gjelder integritet. Probe elektrospray ionisering (PESI) er en såkalt direkte metode fordi det ikke krever kompleks og tidkrevende forbehandling av prøver. En fin nål fungerer som en prøveplukker, samt en ioniseringsemitter. Basert på den svært skarpe og fine egenskapen til sondespissen, er ødeleggelse av prøvene minimal, slik at vi kan skaffe oss sanntidsmolekylær informasjon fra levende ting in situ. Her i dette introduserer vi tre anvendelser av PESI-MS-teknikk som vil være nyttig for biomedisinsk forskning og utvikling. Man innebærer anvendelsen til solid vev, som er den grunnleggende anvendelsen av denne teknikken for medisinsk diagnose. Da denne teknikken bare krever 10 mg av prøven, kan det være svært nyttig i de rutinemessige kliniske innstillingene. Den andre applikasjonen er for in vitro medisinsk diagnostikk hvor humant blodserum måles. Evnen til å måle væskeprøver er også verdifull i ulike biologiske eksperimenter der et tilstrekkelig utvalgsvolum for konvensjonelle analytiske teknikker ikke kan gis. Den tredje applikasjonen lener seg mot direkte påføring av sondenåler hos levende dyr, hvor vi kan oppnå sanntidsdynamikk av metabolitter eller narkotika i bestemte organer. I hvert program kan vi utlede molekylene som har blitt oppdaget av MS eller bruke kunstig intelligens for å få en medisinsk diagnose.

Introduction

Massespektrometri (MS) er en teknologisk realisering av reduksjonisme; det reduserer gjenstand for analyse til en enhet som kan tolkes på grunnlag av molekylære arter eller kaskader. Derfor er det en representativ metode for analytisk kjemi. Den består av fire prosesser: ionisering, analyse, deteksjon og spektraloppkjøp. Fordi ionisering av molekylet er den første prosessen i massespektrometri, begrenser det vanligvis form av analytter som skal behandles. De fleste ioniseringsprosedyrer krever ødeleggelse av strukturen, morfologien og sanntids biologiske prosesser av organiske prøver. For eksempel krever elektrosprayionisering (ESI) MS at prøvene er i flytende tilstand for effektiv ionisering¹. Prøver må derfor gå gjennom et komplekst biokjemisk preparat, som endrer sammensetningen av molekyler. Alternativt, mens matriseassistert laser desorpsjon ionisering (MALDI) MS kan rekonstruere molekylære kart over tynt snittet vev^2,3,er ioniseringseffektiviteten for lav til å oppdage alle molekyler i prøvene, og det er spesielt dårlig til å analysere fettsyrer. Tatt i betraktning disse begrensningene, kan sonde elektrosprayionisering (PESI)⁴ brukes til å observere sanntidsendringene i biologiske systemer in situ uten å ødelegge den strukturelle integriteten⁵, mens den biologiske organismen som observeres er teknisk i en levende tilstand. En veldig fin nål brukes i dette tilfellet som fungerer samtidig som en prøvevelger og en ion emitter. Dette betyr at de komplekse prøveforbehandlingssekvensene kan omgås for å oppnå massespektra som gjenspeiler de molekylære komponentene i levende systemet in situ.

Det finnes flere andre ioniseringsmetoder som rivaliserer PESI-MS. En er rask fordampende ionisering massespektrometri (REIMS)⁶. Denne teknikken fungerer bra under operasjonen fordi den er montert med en elektrisk kniv og samler ionplume generert under snitt. Mens REIMS er svært nyttig for operasjonen, er det i hovedsak en destruktiv metode som krever elektrisk ablasjon av vevet. Derfor er det ikke nyttig for detaljert analyse av celler og vev i en forberedende prøve eller i laboratorieanalyser. Videre, fordi det samler en stor mengde plume som inneholder vevrusk, krever det langvarig vedlikehold av enhetene etter hver bruk, og dermed begrense bruken av denne maskinen til spesielle kirurgiske prosedyrer. En lignende metode, kalt laser desorpsjon serrometri (LDI-MS)⁷, er en annen teknikk som er ikke-invasiv og nyttig for overflateanalysen. Fordi denne teknikken er god til å skanne overflaten av en prøve, oppnår den omfattende todimensjonal analyse som MALDI imaging mass spectrometry^8,9. Men fordi LDI-MS bare gjelder for overflateanalysen, er PESI-MS fordelaktig for å analysere prøvene, for eksempel i vevet. En annen teknikk, MasSpec Pen¹⁰, ble rapportert å oppnå høy spesifisitet og følsomhet i diagnostisering av skjoldbruskkjertelkreft, men diameteren på sonden er i rekkefølge av mm og det er spesifikt for overflateanalysen, noe som betyr at den ikke kan oppdage små knuter av kreft eller dypt lokaliserte lesjoner. Videre, da denne metoden bruker en mikrokapillær strømningskanal innebygd i probepennen, må krysskontaminering tas i betraktning, lik LDI-MS. Andre teknikker finnes som har blitt brukt på kliniske innstillinger, for eksempel flytsonde og ioniseringsform vattpinne¹¹, men de er ikke utbredt.

PESI er ekstrem miniatyrisering av ESI, karakterisert ved at kapillæren til nanoelektrosprayen konvergerer på en solid nål med en tipkrumningsradius på flere hundre nm. Ionisering finner sted i det ekstremt begrensede området av nålespissen ved å danne en Taylor kjegle, hvor prøvene forblir til ionisering av all væsken på spissen er fullført¹². Hvis analyten forblir på tuppen av metallnålen, genereres overflødig ladning kontinuerlig i grensesnittet mellom metallnålen og analytter. Derfor oppstår sekvensiell ionisering av molekyler avhengig av overflateaktiviteten. Denne egenskapen gjør nålen spissen en slags kromatogram, skille analytter avhengig av deres overflateaktivitet. Mer teknisk, molekyler med sterkere overflateaktivitet kommer til overflaten av Taylor kjegle og er ionisert tidligere enn de med svakere overflateaktivitet, som holder seg til overflaten av nålen til slutten av ioniseringsprosessen. Dermed oppnås fullstendig ionisering av alle molekyler plukket opp av nålen¹³. Videre, fordi denne teknikken ikke involverer tillegg av overflødig løsningsmiddel til prøven, er flere hundre femtoliter tilstrekkelig til å få massespektra sterk nok til videre analyse¹⁴. Disse egenskapene er fordelaktige for analyse av intakte biologiske prøver. Men en stor ulempe med PESI-MS ligger i diskontinuiteten i ionisering på grunn av den gjensidige bevegelsen av nålen langs den vertikale aksen, lik en sagingmaskin. Ionisering skjer bare når spissen på sonden når det høyeste punktet når høyden på ionåpningen er justert på den horisontale aksen. Ionisering opphører mens nålen plukker opp prøver, og så stabiliteten av ionisering er ikke lik det i konvensjonell ESI. Pesi-MS er derfor ikke en ideell metode for proteomikk.

Til dags dato har PESI-MS blitt brukt hovedsakelig til analyse av biologiske systemer, som dekker et bredt spekter av felt fra grunnleggende forskning til kliniske innstillinger. For eksempel var den direkte analysen av menneskelig vev utarbeidet under operasjonen i stand til å avsløre akkumulering av triacylglycerol i både nyrecellekarsinom¹⁵ og faryngeal plateepitelkarsinom¹⁶. Denne metoden kan også måle flytende prøver, for eksempel blod, for å fokusere på lipidprofilen. For eksempel har noen molekyler blitt avgrenset under kostholdsendringer i kaniner; Det ble rapportert at noen av disse molekylene redusert i svært tidlige stadier av forsøkene, noe som indikerer høy følsomhet og nytten av dette systemet for klinisk diagnose¹⁷. Videre tillot direkte søknad til et levende dyr påvisning av biokjemiske endringer i leveren etter bare en natt med faste⁵. Zaitsu et al.¹⁸ revisited dette eksperimentet⁵ og analysert metabolske profiler av leveren på nesten samme måte, med resultater som forsterket stabilitetog reproduserbarhet av vår opprinnelige metode. Videre var vi i stand til å diskriminere kreftvevet fra omkringliggende ikke-kreftlever hos mus ved hjelp av denne teknikken¹⁹. Derfor er dette en allsidig massespektrometriteknikk som er nyttig i ulike innstillinger, både in vivo og in vitro. Fra et annet synspunkt kan PESI-modulen gjøres for å passe ulike massespektrometre ved å justere monteringstilbehøret. I denne korte artikkelen introduserer vi det grunnleggende og eksemplene på applikasjoner (Figur 1), inkludert applikasjoner med levende dyr⁵.

I henhold til forskriftene og lovene i hvert land må deler av denne protokollen revideres for å oppfylle kriteriene for hver institusjon. Anvendelse på levende organisme er den mest interessante og utfordrende fordi det kan gi biokjemiske eller metabolske endringer i vev eller organer hos levende dyr in situ. Mens denne søknaden ble godkjent av institusjonellkomité for dyrepleie ved Universitetet i Yamanashi, i 2013^5,vil en annen runde med godkjenning nå være nødvendig på grunn av nylige endringer i regelverket for dyreforsøkene. Flere modifikasjoner i eksperimentell ordningen er derfor tilrådelig. Når det gjelder massespektra oppnådd i eksperimenter, tar svingninger i massespektra mellom hver måling i betraktning, er det ingen spektral informasjonsdelingssystem som er felles for nukleotidsekvenseringssamfunnet. Må utvises når operatøren håndterer kanylen for å unngå kanylestikkulykker, spesielt når nålen fjernes fra nåleholderen. En spesiell enhet for å løsne nålen er svært nyttig for dette formålet. Siden rommet på PESI-modulen er et lufttett, lukket kammer, oppstår ikke lekkasje av ion-plommen hvis massespektrometeret betjenes i henhold til instruksjonene.

Protocol

Den institusjonelle komiteen for dyreomsorg ved Universitetet i Yamanashi godkjente alle protokollene og bruken av eksperimentelle dyr som er oppgitt her. Bruk av menneskelig utvalg ble godkjent av det institusjonelle etikkrådet ved Universitetet i Yamanashi. 1. Solid vev forberedelse MERK: Prøver må holdes på is etter fjerning fra dyret eller menneskekroppen for å bevare vevsfriskheten. Hvis målingene ikke umiddelbart følger disseksjon, anbefales det å lagre …

Representative Results

Som avbildet i figur 3,er dataene innhentet av PESI-MS-teknikken massespektra, hvis m / z varierer fra 10 til 1200 i dette systemet. Mens man kan oppdage molekyler opp til m / z 2000, var det få topper oppnådd ved hjelp av denne teknikken over masseområdet m / z 1200. Derfor analyserte vi topper fra m / z 10 til 1200. Det var iøynefallende grupper av topper rundt m / z 800 og 900; den tidligere representerer ce…

Discussion

Selv om PESI er et derivat av ESI for massespektrometri^4,er det mest fordelaktig for overvåking av metabolomikk i sanntid, samt for å analysere biokjemiske reaksjoner uten å utføre komplekse eller tidkrevende forbehandling^5,14,15,17. Det er en enkel og øyeblikkelig massespektrometri teknikk som kan brukes på den integrerte tilstanden til levende organismer. Siden d…

Materials

5-Fluoro-2'-deoxyuridine (5-FdU)	Sigma-Aldrich	F8791-25MG	25mg
disposable biposy punch (Trepan)	kai Europa GmbH	BP-30F	bore size 3mm
ethanol	nacalai tesque	14710-25	extra pure reagent
LabSolutions	Shimadzu		ver. 5.96, Data analyzer
micropestle	United Scientific Supplies	S13091
microtube	Treff	982855	0.5 mL clear
PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS)	Shimadzu	DPiMS-2020	Mass spectrometer equipped with PESI
PPGT solition	Shimadzu	ND	Attached to DPiMS-2020