Образец Подготовки для зонда Электроспрей ионизации масс-спектрометрии

Summary

В этой статье представлены методы подготовки образцов для уникального аналитического метода в реальном времени, основанного на спектрометрии окружающей среды. Этот метод позволяет нам выполнять в режиме реального времени анализ биологических молекул in vivo без каких-либо специальных предварительных процедур.

Abstract

Масс-спектрометрия (МС) является мощным инструментом в аналитической химии, поскольку она предоставляет очень точную информацию о молекулах, таких как соотношение массы к заряду(м/з),которые полезны для вывода молекулярных весов и структур. Хотя это по существу разрушительный аналитический метод, последние достижения в технологии ионизации окружающей среды позволили нам получить данные, оставляя ткани в относительно нетронутом состоянии с точки зрения целостности. Ионизация электроспрея зонда (PESI) является так называемым прямым методом, поскольку он не требует сложной и трудоемкой предварительной обработки образцов. Тонкая игла служит сборщиком образцов, а также ионизующим излучателем. Основываясь на очень резком и тонком свойстве наконечника зонда, уничтожение образцов является минимальным, что позволяет нам приобретать молекулярную информацию в реальном времени из живых существ на месте. В этом виде мы представляем три применения метода PESI-MS, которые будут полезны для биомедицинских исследований и разработок. Один включает в себя применение к твердой ткани, которая является основным применением этой техники для медицинской диагностики. Поскольку этот метод требует только 10 мг образца, он может быть очень полезным в обычных клинических условиях. Второе применение для медицинской диагностики in vitro, где измеряется сыворотка крови человека. Способность измерять образцы жидкости также имеет значение в различных биологических экспериментах, где не может быть обеспечендостаточный объем выборки для обычных аналитических методов. Третье применение склоняется к прямому применению зондовых игл у живых животных, где мы можем получить динамику метаболитов или наркотиков в конкретных органах в режиме реального времени. В каждом приложении, мы можем сделать вывод молекул, которые были обнаружены MS или использовать искусственный интеллект для получения медицинского диагноза.

Introduction

Масс-спектрометрия (МС) – это технологическая реализация редукционизма; он сводит объект анализа к единице, которая может быть интерпретирована на основе молекулярных видов или каскадов. Поэтому это представительный метод аналитической химии. Он состоит из четырех процессов: ионизация, анализ, обнаружение и спектральное приобретение. Поскольку ионизация молекулы является первым процессом в масс-спектрометрии, она обычно ограничивает форму анализа, которые должны быть обработаны. Большинство процедур ионизации требуют разрушения структуры, морфологии и биологических процессов органических образцов в режиме реального времени. Например, ионизация электроспрея (ESI) MS требует, чтобы образцы были в жидком состоянии для эффективной ионизации^1. Образцы, следовательно, должны пройти через сложный биохимический препарат, который изменяет состав молекул. Кроме того, в то время как матричная лазерная ионизация лазера (MALDI) MS может реконструировать молекулярные карты тонкой секционной ткани^2,3,ее эффективность ионизации слишком низка, чтобы обнаружить все молекулы в образцах, и это особенно плохо при анализе жирных кислот. Учитывая эти ограничения, зонд электроспреп ионизации (PESI)⁴ может быть использован для наблюдения в режиме реального времени изменения в биологических системах на месте, не разрушая структурную целостность⁵, в то время как биологический организм наблюдается технически в живом состоянии. В этом случае используется очень тонкая игла, которая одновременно служит сборщиком образцов и ионного излучателя. Это означает, что сложные последовательности предварительной обработки образцов могут быть обойдёны для получения масс-спектров, отражающих молекулярные компоненты живой системы на месте.

Есть несколько других методов ионизации, которые соперничают PESI-MS. Одним из них является быстрая испаряемый ионизации масс-спектрометрии (REIMS)⁶. Этот метод хорошо работает во время операции, потому что он собран с электрическим ножом и собирает ионный шлейф, генерируемый во время разреза. Хотя REIMS очень полезен для операции, это по существу разрушительный метод, который требует электрической абляции тканей. Поэтому он не полезен для детального анализа клеток и тканей в подготовительном образце или в лабораторных анализах. Кроме того, поскольку он собирает большое количество шлейфа, содержащего тканевый мусор, он требует длительного обслуживания устройств после каждого использования, тем самым ограничивая использование этой машины специальными хирургическими процедурами. Аналогичный метод, называемый лазерной ионизации ионизации масс-спектрометрии (LDI-MS)⁷, является еще одним методом, который является неинвазивным и полезным для анализа поверхности. Поскольку этот метод хорош в сканировании поверхности образца, он достигает всеобъемлющего двумерного анализа, как MALDI изображений масс-спектрометрии^8,9. Однако, поскольку LDI-MS применим только к анализу поверхности, PESI-MS является выгодным для анализа образцов, например, в ткани. Другой метод, MasSpec Pen¹⁰, было сообщено для достижения высокой специфичности и чувствительности в диагностике рака щитовидной железы, но диаметр зонда находится в порядке мм и он специфичен для анализа поверхности, а это означает, что он не может обнаружить небольшие узелки рака или глубоко локализованных поражений. Кроме того, поскольку этот метод использует микрокапиллярный канал потока, встроенный в перо зонда, необходимо принимать во внимание перекрестное загрязнение, аналогичное LDI-MS. Существуют и другие методы, которые были применены в клинических условиях, таких как поток зонда и ионизации форме тампон¹¹, но они не являются широко распространенными.

PESI является крайней миниатюризации ESI, в котором капилляр нано-электроспреп сходится на твердой игле с наконечником кривизны радиусом в несколько сотен нм. Ионизация происходит в крайне ограниченной области кончика иглы путем формирования конуса Тейлор, на котором образцы остаются до ионизации всей жидкости на кончике^{завершена 12}. Если аналитик остается на кончике металлической иглы, избыточный заряд непрерывно генерируется на интерфейсе между металлической иглой и аналитиками. Поэтому последовательная ионизация молекул происходит в зависимости от их поверхностной активности. Это свойство делает кончик иглы своего рода хроматограммой, разделяющей аналиты в зависимости от их поверхностной активности. Более технически, молекулы с более сильной поверхностной активностью приходят к поверхности конуса Taylor и ионизируется более раньше чем те с более слабой деятельностью поверхности, которые придерживаются к поверхности иглы до конца процесса ионизации. Таким образом, полная ионизация всех молекул, подобранных иглой, достигается^13. Более того, поскольку эта методика не предполагает добавления в образец лишнего растворителя, нескольких сотен фемтолитров достаточно, чтобы получить массу спектра достаточно прочной для дальнейшего анализа^14. Эти свойства выгодны для анализа нетронутых биологических образцов. Однако основным недостатком PESI-MS является разрыв в ионизации из-за взаимного движения иглы по вертикальной оси, похожей на распиловочная машина. Ионизация происходит только тогда, когда кончик зонда достигает высшей точки, когда высота ионного илиа выравнивается по горизонтальной оси. Ионизация прекращается, в то время как игла берет образцы, и поэтому стабильность ионизации не равна той, что в обычных ESI. Таким образом, PESI-MS не является идеальным методом для протеомики.

На сегодняшний день PESI-MS применяется главным образом к анализу биологических систем, охватывающих широкий спектр областей от фундаментальных исследований до клинических условий. Например, прямой анализ тканей человека, подготовленный во время операции, смог выявить накопление триацилглицерола как в почечно-клеточной карциномы^15, так и в фарингеальной плоской карциномы^16. Этот метод может также измерить жидкие образцы, такие как кровь, чтобы сосредоточиться на липидном профиле. Например, некоторые молекулы были очертаны во время диетических изменений у кроликов; было сообщено, что некоторые из этих молекул уменьшилась на очень ранних стадиях экспериментов, что свидетельствует о высокой чувствительности и полезности этой системы для клинической диагностики¹⁷. Кроме того, прямое применение к живому животному позволило обнаружить биохимические изменения печени после всего лишь одной ночи поста^5. Зайцу и др.¹⁸ вновь этот эксперимент⁵ и проанализировали метаболические профили печени почти таким же образом, с результатами, которые укрепили стабильность и воспроизводимость нашего первоначального метода. Кроме того, мы смогли различать ткани рака от окружающих нераковых печени у мышей с помощью этой^{техники 19}. Таким образом, это универсальный метод масс-спектрометрии, который полезен в различных условиях, как in vivo, так и in vitro. С другой стороны, модуль PESI может быть выполнен в соответствии с различными масс-спектрометрами, регулируя крепление. В этой короткой статье мы представляем основы и примеры приложений(рисунок 1), включая приложения с живыми животными⁵.

В соответствии с положениями и законами каждой страны некоторые части этого протокола должны быть пересмотрены в соответствии с критериями каждого учреждения. Применение к живому организму является наиболее интересным и сложным, поскольку оно может обеспечить биохимические или метаболические изменения в тканях или органах у живых животных на месте. Хотя эта заявка была одобрена институциональным комитетом по уходу за животными в Университете Яманаси, в 2013 году⁵, еще один раунд утверждения теперь будет необходимо из-за недавних изменений в правилах для экспериментов на животных. Поэтому целесообразно внести несколько изменений в экспериментальную схему. Что касается масс-спектров, полученных в ходе экспериментов, учитывая колебания масс-спектров между каждым измерением, то не существует системы спектрального обмена информацией, которая характерна для сообщества секвенирования нуклеотидов. Необходимо проявлять осторожность, когда оператор обрабатывает иглу, чтобы избежать несчастных случаев иглы, особенно при удалении иглы из держателя иглы. Специальное устройство для отсоединения иглы очень полезно для этой цели. Поскольку отсек модуля PESI представляет собой герметичную, закрытую камеру, утечка ионного шлейфа не происходит, если масс-спектрометр работает в соответствии с инструкциями.

Protocol

Институциональный комитет по уходу за животными при Университете Яманаси утвердил все протоколы и использование экспериментальных животных, изложенных в настоящем. Использование образцов человека было одобрено институциональным советом по этике при Университете Яманаси. <p class="jove…

Representative Results

Как показано на рисунке 3, данные, полученные методом PESI-MS, являются масс-спектрами, м/з которых в этой системе колеблется от 10 до 1200. В то время как можно обнаружить молекулы до м / z 2000, было несколько пиков, полученных с помощью этой техники в диа…

Discussion

Хотя PESI является производным ESI для масс-спектрометрии^4,это наиболее выгодно для мониторинга в режиме реального времени метаболомики, а также для анализа биохимических реакций без выполнения каких-либо сложных или трудоемких предварительных процедур^5,<s…

Materials

5-Fluoro-2'-deoxyuridine (5-FdU)	Sigma-Aldrich	F8791-25MG	25mg
disposable biposy punch (Trepan)	kai Europa GmbH	BP-30F	bore size 3mm
ethanol	nacalai tesque	14710-25	extra pure reagent
LabSolutions	Shimadzu		ver. 5.96, Data analyzer
micropestle	United Scientific Supplies	S13091
microtube	Treff	982855	0.5 mL clear
PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS)	Shimadzu	DPiMS-2020	Mass spectrometer equipped with PESI
PPGT solition	Shimadzu	ND	Attached to DPiMS-2020