Detektion av 5-Hydroximetylcytosin i neurala stamceller och hjärnor av möss
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att detektera 5-hydroximetylcytosin i celler och hjärnvävnader, utnyttjar immunofluorescensfärgning och DNA-punktblot-metoder.
Abstract
Flera DNA-modifieringar har identifierats i däggdjurs arvsmassan. Av detta har 5-metylcytosin och 5-hydroximetylcytosinmedierade epigenetiska mekanismer studerats intensivt. 5-hydroximetylcytosin visar dynamiska egenskaper under embryonal och postnatal utveckling av hjärnan, spelar en reglerande funktion i genuttryck, och är involverad i flera neurologiska sjukdomar. Här beskriver vi de detaljerade metoder inklusive immunofluorescensteknik färgning och DNA dot-blot att upptäcka 5-hydroxymetylcytosin i odlade celler och hjärnan vävnader av mus.
Introduction
Epigenetiska modifikationer, inklusive DNA-modifiering, histonmodifiering och RNA-modifiering, har visat sig spela viktiga funktioner i olika biologiska processer och sjukdomar1,2,3, 4 , ,5 , 6 , 7. under lång tid har DNA-metylering (dvs. 5-metylcytosin (5-MC)) visats som en mycket stabil epigenetisk markör och kan inte modifieras ytterligare i genomet. Nyligen, det har visat sig att 5-MC kan oxideras till 5-hydroxymethylcytosine (5-HMC) av tet (tio-eleven translokationer) familj proteiner inklusive TET1, TET2, och TET38,9. Ytterligare studier visar att 5-HMC kan fungera som en stabil markör och spela biologiska roller genom att reglera genuttryck4,10,11,12.
De nuvarande bevisen tyder på att 5-HMC är mycket berikat i neuronala vävnader/celler i förhållande till andra typer av vävnader hos däggdjur, och uppvisar dynamiska egenskaper under neuronala utveckling13,14. I neuronala systemet, 5-hmC medierade epigenetiska modifieringar spelar en viktig roll i regleringen av neurala stamceller, neuronala aktivitet, inlärning och minne, och är involverad i flera neurologiska sjukdomar inklusive Rett syndrom, autism, Alzheimers sjukdom, Huntingtons sjukdom, etc.2,13,15,16,17,18,19,20.
Det finns flera metoder för att upptäcka 5-HMC i celler och vävnader14,21,22,23,24. Här beskriver vi två metoder för att upptäcka förekomsten av 5-hmC och kvantifiera den globala nivån av 5-hmC: färgning av immunofluorescensteknik och DNA dot-blot. Dessa två metoder är bekväma och känsliga, och har framgångsrikt använts i tidigare studier25,26,27,28,29,30. De viktigaste stegen i dessa två metoder är DNA-denaturering. För immunofluorescenfärgning av 5-hmC krävs förbehandling av prover med 1 M HCl. För 5-hmC dot-blot utförs DNA-denaturering med NaOH-lösning. Dessa två metoder tillsammans med nästa generations sekvensering är mycket användbara verktyg för att undersöka funktionen av 5-hmC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Epigenetiska modifikationer spelar viktiga roller under hjärnans utveckling, mognad och funktion. Som en stabil markör för DNA-modifiering, dynamisk 5-hmC svarar på beteendemässig anpassning, neuronala aktivitet, och är positivt korrelerad med genuttryck; Sålunda, det är involverat i hjärnans normala funktion och neurologiska störning4. För att utforska dess funktion i celler och vävnader, är det nödvändigt att upptäcka förekomsten av 5-hmC och jämföra nivån före och efter beh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
XL stöddes delvis av den nationella nyckeln R & D program i Kina (2017YFE0196600), och National Natural Science Foundation i Kina (Grant nos. 31771395, 31571518). Q.S. stöddes av Kinas nationella centrala forsknings-och utvecklingsprogram (2017YFC1001703) och det centrala forsknings-och utvecklingsprogrammet i Zhejiang-provinsen (2017C03009). W.X. stöddes av Natural Science Foundation i Zhejiang-provinsen (LY18H020002) och Science Technology-avdelningen i Zhejiang-provinsen (2017C37057).
Materials
| 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ) | Sigma-Aldrich | D8417 |
| Adobe Photoshop software | Adobe Inc. | / |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A11008 |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A11001 |
| anti-5-hydroxymethylcytosine | Active Motif | 39769 |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 |
| B27 supplement | Gibco | 12587-010 |
| B27 supplement | Gibco | 12580-010 |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 |
| Cryostat microtome | Leica | CM1950 |
| DMEM/F-12 medium | OmegaScientific | DM25 |
| epidermal growth factor | PeproTech | 100-15 |
| Fibroblast growth factor-basic | PeproTech | 100-18B |
| forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 |
| GlutaMax | Thermo | 35050061 |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-149 |
| neurobasal medium | Gibco | 21103-049 |
| normal goat serum | Vector Laboratories | Z0325 |
| nylon membrane (Hybond™-N+ ) | Amersham Biosciences | RPN303B |
| OCT | Leica | 14020108926 |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 |
| phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 ) | Sigma-Aldrich | 516726 |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P0899-10 |
| proteinase K | VVR | 39450-01-6 |
| retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 |
| Triton X-100 | Solarbio | T8210 |
References
- Tan, L., Shi, Y. G. Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease. Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).
- Yao, B., et al. Epigenetic mechanisms in neurogenesis. Nature Reviews Neuroscience. 17 (9), 537-549 (2016).
- Day, J. J., Sweatt, J. D. DNA methylation and memory formation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1319-1323 (2010).
- Wu, X. J., Zhang, Y. TET-mediated active DNA demethylation: mechanism, function and beyond. Nature Reviews Genetics. 18 (9), 517-534 (2017).
- Sun, W. J., Guan, M. X., Li, X. K. 5-Hydroxymethylcytosine-Mediated DNA Demethylation in Stem Cells and Development. Stem Cells and Development. 23 (9), 923-930 (2014).
- Li, S., Mason, C. E. The pivotal regulatory landscape of RNA modifications. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 15, 127-150 (2014).
- Hwang, J. Y., Aromolaran, K. A., Zukin, R. S. The emerging field of epigenetics in neurodegeneration and neuroprotection. Nature Reviews Neuroscience. 18 (6), 347-361 (2017).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324 (5929), 929-930 (2009).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-Methylcytosine to 5-Hydroxymethylcytosine in Mammalian DNA by MLL Partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
- Guo, J. U., et al. Neuronal activity modifies the DNA methylation landscape in the adult brain. Nature Neuroscience. 14 (10), 1345-1351 (2011).
- Feng, J., et al. Dnmt1 and Dnmt3a maintain DNA methylation and regulate synaptic function in adult forebrain neurons. Nature Neuroscience. 13 (4), 423-430 (2010).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Geneticset. , 245-254 (2003).
- Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), (2011).
- Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
- Shu, L. Q., et al. Genome-wide alteration of 5-hydroxymenthylcytosine in a mouse model of Alzheimer’s disease. BMC Genomics. 17, (2016).
- Cruvinel, E., et al. Reactivation of maternal SNORD116 cluster via SETDB1 knockdown in Prader-Willi syndrome iPSCs. Human molecular genetics. 23 (17), 4674-4685 (2014).
- Bernstein, A. I., et al. 5-Hydroxymethylation-associated epigenetic modifiers of Alzheimer’s disease modulate Tau-induced neurotoxicity. Human Molecular Genetics. 25 (12), 2437-2450 (2016).
- Wang, F. L., et al. Genome-wide loss of 5-hmC is a novel epigenetic feature of Huntingtons disease. Human Molecular Genetics. 22 (18), 3641-3653 (2013).
- Yu, H., et al. Tet3 regulates synaptic transmission and homeostatic plasticity via DNA oxidation and repair. Nature Neuroscience. 18 (6), 836-843 (2015).
- Wu, H., Zhang, Y. Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions. Cell. 156 (1-2), 45-68 (2014).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341 (6146), 1237905 (2013).
- Inoue, A., Zhang, Y. Replication-Dependent Loss of 5-Hydroxymethylcytosine in Mouse Preimplantation Embryos. Science. 334 (6053), 194 (2011).
- Pastor, W. A., et al. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).
- Ito, S., et al. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466 (7310), (2010).
- Wang, T., et al. Genome-wide DNA hydroxymethylation changes are associated with neurodevelopmental genes in the developing human cerebellum. Human Molecular Genetics. 21 (26), 5500-5510 (2012).
- Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
- Wang, T., et al. Subtelomeric hotspots of aberrant 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic modifications during reprogramming to pluripotency. Nature Cell Biology. 15 (6), 700-711 (2013).
- Li, X., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, 15903 (2017).
- Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), 1607-1616 (2011).
- Tao, H., et al. The Dynamic DNA Demethylation during Postnatal Neuronal Development and Neural Stem Cell Differentiation. Stem Cells International. 2018, 2186301 (2018).
- Li, X. K., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, (2017).
- Li, X., et al. Epigenetic regulation of the stem cell mitogen Fgf-2 by Mbd1 in adult neural stem/progenitor cells. Journal of Biological Chemistry. 283 (41), 27644-27652 (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
