Summary

Il rilevamento di 5-Hydroxytethylcytosine in cellule staminali neurali e cervelli di topi

Published: September 19, 2019
doi:

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per rilevare 5-idrossimetilcitosina nelle cellule e tessuti cerebrali, utilizzando immunofluorescenza colorazione e metodi di DNA dot-blot.

Abstract

Sono state identificate diverse modifiche del DNA nel genoma dei mammiferi. Di questi, sono stati studiati intensamente i meccanismi epigenetici mediati da 5-metilcytosina e 5-idrossimethylcytosine. 5-idrossimetilcitosina mostra caratteristiche dinamiche durante lo sviluppo embrionale e postnatale del cervello, svolge una funzione regolatrice nell’espressione genica, ed è coinvolto in più disturbi neurologici. Qui, descriviamo i metodi dettagliati tra cui l’immunofluorescenza colorazione e DNA dot-blot per rilevare 5-idrossimetilcitosina nelle cellule coltivate e tessuti cerebrali del topo.

Introduction

Le modifiche epigenetiche, tra cui la modificazione del DNA, la modificazione dell’istone e la modificazione dell’RNA, hanno dimostrato di svolgere funzioni essenziali in diversi processi biologici e malattie1,2,3, 4 DEL psu’ , 5 Del numero 3( , 6 È possibile: , 7. Per lungo tempo, la metilazione del DNA (cioè la metilcitosina 5 mC) è stata vista come un marcatore epigenetico altamente stabile e non può essere ulteriormente modificata nel genoma. Recentemente, è stato scoperto che 5-mC potrebbe essere ossidato a 5-idrossimetilcitosina (5-hmC) da TET (Dieci-undici traslocazioni) proteine di famiglia tra cui TET1, TET2, e TET38,9. Ulteriori studi dimostrano che 5-hmC potrebbe fungere da marcatore stabile e svolgere ruoli biologici attraverso la regolazione dell’espressione genica4,10,11,12.

Le prove attuali indicano che 5-hmC è altamente arricchito nei tessuti neuronali / cellule rispetto ad altri tipi di tessuti nei mammiferi, e presenta caratteristiche dinamiche durante lo sviluppo neuronale13,14. Nel sistema neuronale, le modifiche epigenetiche mediate a 5-hmC svolgono un ruolo importante nella regolazione delle cellule staminali neurali, dell’attività neuronale, dell’apprendimento e della memoria, ed è coinvolta in molteplici disturbi neurologici tra cui la sindrome di Rett, l’autismo, l’Alzheimer malattia di Huntington, ecc.2,13,15,16,17,18,19,20.

Ci sono diversi approcci per rilevare 5-hmC in cellule e tessuti14,21,22,23,24. Qui, descriviamo due metodi per rilevare l’esistenza di 5-hmC e quantificare il livello globale di 5-hmC: colorazione immunofluorescenza e DNA dot-blot. Questi due metodi sono convenienti e sensibili, e sono stati utilizzati con successo negli studi precedenti25,26,27,28,29,30. I passaggi chiave di questi due metodi sono la denaturazione del DNA. Per la colorazione immunofluorescenza di 5-hmC, è necessario pre-trattamento di campioni con 1 M HCl. Per una macchia di punti da 5-hmC, la denaturazione del DNA viene eseguita con soluzione NaOH. Questi due metodi insieme al sequenziamento di nuova generazione sono strumenti molto utili per studiare la funzione di 5-hmC.

Protocol

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal Comitato Etico Animale dell’Università di Hejiang. 1. La coltura delle cellule staminali neurali adulte e dei neuroni Isolare le cellule staminali neurali adulte dal prosencefalo di un adulto (8-10 settimane) mouse maschio C57/BL6 come descritto in precedenza31,32. Coltura cellule staminali neurali adulte in DMEM/F-12 medio contenente 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/m…

Representative Results

Per rivelare la distribuzione di 5-hmC nell’ippocampo di topi adulti, abbiamo eseguito l’immunofluorescenza con anticorpi contro le cellule neuronali (NeuN) e 5-hmC. Nell’ippocampo, 5-hmC co-localizzato bene con marcatore cellulare neuronale NeuN (Figura 1A-H), suggerendo un arricchimento di 5-hmC nei neuroni. Per determinare la dinamica di 5-hmC durante lo sviluppo neuronale, è stato eseguito un punto-blot con campioni di DNA isolati da cellule …

Discussion

Le modifiche epigenetiche svolgono un ruolo essenziale durante lo sviluppo cerebrale, la maturazione e la funzione. Come marcatore stabile per la modifica del DNA, dinamico 5-hmC risponde all’adattamento comportamentale, all’attività neuronale, ed è positivamente correlato con l’espressione genica; così, è coinvolto nella normale funzione del cervello e disturbo neurologico4. Per esplorare la sua funzione nelle cellule e nei tessuti, è necessario rilevare l’esistenza di 5-hmC e confrontare il…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

XL è stata sostenuta in parte dal National Key R&D Program of China (2017YFE0196600) e dalla National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 31771395, 31571518). Q.S. è stato sostenuto dal National Key Research and Development Program of China (2017YFC1001703) e dal Key Research and Development Program della provincia di ehejiang (2017C03009). W.X. è stato sostenuto dalla Fondazione di Scienze Naturali della provincia di ejiang (LY18H020002) e dal Dipartimento di Tecnologia Della Scienza della provincia di Ehejiang (2017C37057).

Materials

4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ) Sigma-Aldrich D8417
Adobe Photoshop software Adobe Inc. /
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher A11008
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG Thermo Fisher A11001
anti-5-hydroxymethylcytosine Active Motif 39769
anti-NeuN Millipore MAB377
B27 supplement Gibco 12587-010
B27 supplement Gibco 12580-010
B27 supplement Gibco 17504-044
Cryostat microtome Leica CM1950
DMEM/F-12 medium OmegaScientific DM25
epidermal growth factor PeproTech 100-15
Fibroblast growth factor-basic PeproTech 100-18B
forskolin Sigma-Aldrich F6886
GlutaMax Thermo 35050061
L-Glutamine Gibco 25030-149
neurobasal medium Gibco 21103-049
normal goat serum Vector Laboratories Z0325
nylon membrane (Hybond™-N+ ) Amersham Biosciences RPN303B
OCT Leica 14020108926
Pen Strep Gibco 15140-122
phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 ) Sigma-Aldrich 516726
Poly-D-Lysine Sigma P0899-10
proteinase K VVR 39450-01-6
retinoic acid Sigma-Aldrich R2625
Triton X-100 Solarbio T8210

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Cite This Article
Zhuang, Y., Chen, J., Xu, W., Shu, Q., Li, X. The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice. J. Vis. Exp. (151), e59950, doi:10.3791/59950 (2019).

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