I denne undersøgelse præsenterer vi en protokol for cortisol ekstraktion fra fin og kæbeknogle af stør arter. Finne-og kæbe knoglekortisolniveauerne blev yderligere undersøgt ved at sammenligne to vaskemidler efterfulgt af ELISA-assays. Denne undersøgelse undersøgtes gennemførligheden af Jawbone cortisol som en ny stress indikator.
Formålet med denne undersøgelse var at udvikle en teknik til ekstraktion af cortisol fra stør finner ved hjælp af to vaskemidler (vand og isopropanol) og kvantificere eventuelle forskelle i finkortisolniveauerne blandt tre primære stør arter. Finnerne blev høstet fra 19 ofrede Sturgeons, herunder syv Beluga (Huso Huso), syv sibiriske (Acipenser Acipenser) og fem Sevruga (A. Acipenser). De Sturgeons blev rejst i iranske gårde i 2 år (2017-2018), og cortisol udvinding analyse blev gennemført i Sydkorea (januar-februar 2019). Kæbe knogler fra fem H. Huso blev også brugt til cortisol ekstraktion. Data blev analyseret ved hjælp af GLM-proceduren (General Linear Model) i SAS-miljøet. De intra-og Inter-assay koefficienter for variation var henholdsvis 14,15 og 7,70. Kort sagt omfattede cortisol ekstraktions teknikken vask af prøverne (300 ± 10 mg) med 3 mL solvens (ultrapure vand og isopropanol) to gange, rotation ved 80 rpm for 2,5 min, lufttørring af de vaskede prøver ved stuetemperatur (22-28 °C) i 7 dage, yderligere tørring prøverne ved hjælp af en perle beater ved 50 Hz for 32 min og slibning dem i pulver, anvende 1,5 mL methanol til tørret pulver (75 ± 5 mg), og langsom rotation (40 rpm) for 18 h ved stuetemperatur med kontinuerlig blanding. Efter ekstraktion blev prøverne centrifugeret (9.500 x g i 10 min), og 1 ml supernatanten blev overført til et nyt mikrocentrifuge glas (1,5 ml), inkuberet ved 38 °c for at fordampe methanol og analyseret via enzym relateret immunosorbent assay (ELISA) . Der blev ikke observeret nogen forskelle i finkortisolniveauerne blandt arterne eller i kortisolniveauerne for fin-og kæbe knogler mellem vaskemidler. Resultaterne af denne undersøgelse viser, at Sturgeon Jawbone matrix er en lovende alternativ stress indikator for solide matricer.
Cortisol er en pålidelig indikator for dyrs stress. Cortisol udvinding giver en gyldig ramme for forskere til at overvåge stress niveauer og generelle mønstre i stressorer. For eksempel, tidligere undersøgelser har gennemført metodologisk validering af hår cortisol målinger ved hjælp af forskellige metoder i mennesker1,2, aber3,4, kvæg5, får6, og guldfisk7,8. I fiskearter, cortisol målinger i matricer såsom skalaer, hud slim, fæces, og blod9 har vist sig at give oplysninger om fisk sundhed. Når blodprøvetagning er problematisk eller skalaer mangler, alternative matricer til cortisol ekstraktion er nødvendige. I fisk kan alternative matricer omfatte kæbeknoglen, et hårdt væv svarende til den menneskelige tand10.
Udviklingen af nye matricer og validerede teknikker til at bestemme fiske stress niveauer er af særlig interesse for kaviar industrien, hvor stør kan opleve langvarig udsættelse for miljømæssige stressfaktorer11. Kønnet af stør kan ikke bestemmes før 2 år, og stør har ikke skalaer. Fordi cortisol gradvist ophobes i solide matricer under vækst stadiet2,7,12, langsigtede cortisol akkumulering data fra hårde matricer såsom finner og kæbe knogler kunne give indsigt i stress niveauer i forskellige vækststadier. I modsætning hertil giver blod kortisolniveauerne et øjebliksbillede af stressniveauet på dødstidspunktet og kan ikke præcist repræsentere stress under langvarige opdrætsforhold13,14. Med den stigende konkurrence på kaviar markedet er nye tilgange til forbedring af stress betingelserne for produktion af sundere æg blandt størarter under lang tids opdræt (8-12 år eller længere) et stadigt vigtigere forskningsområde. På grund af de høje omkostninger ved stør, høstes prøver er ekstremt dyrt ($ 8000-15000 pr modne fisk afhængigt af arter og vækstfase), en begrænsende faktor for forskningsprojekter. Udviklingen af en hensigtsmæssig teknik til kortisoludvinding fra stør finner og kæbe knogler kan dog med fordel anvendes både på fiske opdrætssystemer og i vildtlevende fisk for at forbedre kvaliteten og høsten af stør-æg til både konsum og Bevarelse.
Ud over at give pålidelige resultater6er udvælgelsen af en passende cortisol ekstraktionsteknik af afgørende betydning for at sikre, at andre forbindelser, der findes i matrixen under prøvepræparation, ikke tolerererproduktionen, hvilket kan føre til usammenhængende resultater. Det er lige så vigtigt at afgøre, om fin og kæbeknogle cortisol niveauer er påvirket af hormonniveauer i det omgivende vand. Heimbürge et al.15 foreslog, at en række faktorer kan påvirke cortisol niveauer, herunder alder, køn, graviditet, sæson, farve12, og kroppen region, hvorfra cortisol udvindes16. Der foreligger dog kun få oplysninger om virkningerne af vaskemidler på cortisol ekstraktion i fisk krop matricer8, og ingen om disse virkninger i stør, undtagen for stør æg17.
Selvom analysere baseline cortisol niveauer fra finner og kæbe knogler af stør kræver, at fiskene skal euthanized, denne fremgangsmåde ikke indebærer invasive teknikker, der kræves for blodprøvetagning i levende stør. Prøver af fin-og kæbeknogle opsamles let, og ekstraktion fra disse væv kan udføres hurtigt. Tilsvarende, hormon udvinding og analyse er ligetil og kræver lidt specialiseret udstyr.
I denne undersøgelse præsenterer vi en ny og let anvendt teknik til ekstraktion, vask og bestemmelse af cortisol fra fiske finner og kæbe knogler, med det formål at bestemme, om cortisol niveauer målt fra disse matricer kan anvendes pålideligt som stress Indikatorer. Fordelene ved denne teknik omfatter en nem og ikke-invasiv8 tilgang, mindre data variation, og pålidelig udgang1,6,8,17; teknikken gælder for fiskearter uden skalaer såsom stør. Teknikken kræver slagtning af fiskene, udvælgelse af passende vaskemidler2,4, korrekt slibning af prøver3,5, professionel enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA) ansøgning5,7, og omfattende viden om inkorporering af cortisol kilder i solide matricer6.
Vi anvendte to forskellige vaskemidler (ultrarent vand og isopropanol) for at opnå basal kortisolniveauer i finner fra tre stør arter: Beluga (Huso Huso), Sibirisk (Acipenser Acipenser) og Sevruga (A. Acipenser ), under normale miljøforhold for hver art. Kæbe knogler af H. Huso blev også brugt til at evaluere stress i stør. Dette er den første undersøgelse for at måle cortisol niveauer i Sturgeon jawbones. Resultaterne af denne undersøgelse vil give sammenlignende cortisol data for stør arter i den tidlige vækstfase (~ 1 år) forud for kønsbestemmelse.
Sturgeon kaldes sommetider en “levende fossil”, fordi det har udstillet nogle få tilpasninger i løbet af de sidste årtusinder. Sturgeon slægten Acipenser indeholder 27 arter, der producerer kaviar; imidlertid producerer tre arter (Beluga, Baerii og Sevruga) det meste af den globale kaviar forsyning. Stør er sårbar over for overfiskning og interferens i deres naturlige habitat og er derfor mere kritisk truet end nogen anden gruppe af arter. Sturgeon tilhører den ældste gruppe af levende hvirveldyr, som ha…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev udført med støtte fra det kooperative forsknings program for landbrug videnskab & teknologiudvikling (Projekttitel: husdyr produktivitet ændring analyse med klimaændringer, projekt nr. PJ012771), administration af udvikling af landdistrikter, Republikken Korea. Denne undersøgelse blev også støttet af et tilskud (nr. PJ01344604) fra Animal Nutrition & Physiology-teamet, National Institute of Animal Science, RDA, Seoul, Republikken Korea. Forfatterne anerkender taknemmeligt Persisk gestus CEO Mohammad Hassan Salmanzadeh og hans team, der leverede fisk fra de tre stør arter undersøgt i denne undersøgelse.
Disposal latex surgical gloves | Ansell | 63754090 |
Platform scale-electronic weighing 100kg | Baskoolnikoo | 101 EM |
Serological pipette to deliver up to 24 mL | Becton Dickinson Falcon | 35-7550 |
Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters | BioTek | 8041000 |
Reagent reservoirs | BrandTech | 703459 |
Zipper storage plastic bag | Cleanwrap | 30cm x100m |
Isopropyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5035-4400 |
Methyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5558-4100 |
Tube rotator- MX-RL-Pro | DLAB Scientific | 824-222217777 |
Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL | Eppendorf Research Plus | M21518D |
Precision pipette to deliver 15 and 25 μL | Eppendorf Research Plus | R25623C |
Weighing paper (107 x 210 mm) | Fisherbrand | 09-898-12B |
Bead beater, 50/60 Hz 2A | GeneReach Biotechnology Corp | tp0088 |
Plate rotator with orbit capable of 500 rpm | Hangzhou Miu Instrument | MU-E30-1044 |
Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL | Hyundai Micro | H20050 |
Fume hood | Kwang Dong Industrial | KD 901-22128175 |
Micro-centrifuge capable of 1500 x g | Labo Gene | 9.900.900.729 |
Mini vortex mixer | LMS | VTX-3000L |
Lotte aluminum foil roll | Lotte Aluminum | B0722X5FK5 |
Digital scale | Mettler Toledo | ME204 |
Ultrapure water | MDM | MDM-0110 |
Pipette tips | Neptune Scientific | REF 2100.N |
Large fish net | Pond H2O | Hoz135 |
Salivary cortisol kit | Salimetrics | 1-3002-4 |
Bone cutting forceps | Sankyo | 26-188A |
Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL | VITLAB | 18A68756 |
Towel | Yuhan Kimberly | 1707921546 |
Tissue paper (107 × 210) | Yuhan Kimberly | 41117 |