Summary

Extraction de cortisol à partir de matrices de nageoires d'esturgeon et de mâchoires

Published: September 10, 2019
doi:

Summary

Dans cette étude, nous présentons un protocole pour l’extraction de cortisol de la nageoire et de la mâchoire des espèces d’esturgeons. Les niveaux de cortisol de fin et de mâchoire ont été plus loin examinés en comparant deux solvants de lavage suivis des essais d’ELISA. Cette étude a mis à l’essai la faisabilité du cortisol de mâchoire comme indicateur de stress nouveau.

Abstract

Les objectifs de cette étude étaient de développer une technique pour l’extraction du cortisol à partir d’ailerons d’esturgeon à l’aide de deux solvants de lavage (eau et isopropanol) et de quantifier les différences dans les niveaux de cortisol des nageoires parmi trois principales espèces d’esturgeons. Les nageoires ont été récoltées à partir de 19 esturgeons sacrifiés, dont sept bélugas (Huso huso), sept Sibériens (Acipenser baerii), et cinq sevruga (A. stellatus). Les esturgeons ont été élevés dans des fermes iraniennes pendant deux ans (2017-2018), et l’analyse de l’extraction du cortisol a été menée en Corée du Sud (janvier-février 2019). Des mâchoires de cinq H. huso ont également été employées pour l’extraction de cortisol. Les données ont été analysées à l’aide de la procédure générale de modèle linéaire (GLM) dans l’environnement SAS. Les coefficients de variation intra- et inter-assay étaient respectivement de 14,15 et 7,70. En bref, la technique d’extraction du cortisol consistait à laver les échantillons (300 à 10 mg) avec 3 ml de solvant (eau ultrapure et isopropanol) deux fois, rotation à 80 tr/min pendant 2,5 min, séchage à l’air des échantillons lavés à température ambiante (22-28 oC) pendant 7 jours, séchage supplémentaire les échantillons à l’aide d’un batteur de perles à 50 Hz pendant 32 min et les broyant en poudre, en appliquant 1,5 ml de méthanol à la poudre séchée (75 à 5 mg), et la rotation lente (40 tr/min) pendant 18 h à température ambiante avec mélange continu. Après extraction, les échantillons ont été centrifuges (9 500 x g pour 10 min), et 1 mL de supernatant a été transféré dans un nouveau tube de microcentrifuge (1,5 mL), incubé à 38 oC pour évaporer le méthanol, et analysé par l’intermédiaire d’un essai immunosorbent lié aux enzymes (ELISA) . Aucune différence n’a été observée dans les niveaux de cortisol des nageoires chez les espèces ou dans les niveaux de cortisol des nageoires et des mâchoires entre les solvants de lavage. Les résultats de cette étude démontrent que la matrice de mâchoire d’esturgeon est un indicateur alternatif prometteur d’effort aux matrices pleines.

Introduction

Le cortisol est un indicateur fiable du stress animal. L’extraction de cortisol fournit un cadre valide pour les chercheurs pour surveiller les niveaux de stress et les modèles généraux dans les facteurs de stress. Par exemple, des études antérieures ont mené la validation méthodologique des mesures de cortisol de cheveux utilisant diverses méthodes chez l’homme1,2, singes3,4, bovins5, moutons6, et poisson rouge7,8. Chez les espèces de poissons, il a été démontré que les mesures du cortisol dans des matrices telles que les écailles, le mucus cutané, les excréments et le sang9 fournissent des informations sur la santé des poissons. Lorsque l’échantillonnage sanguin est problématique ou que les écailles font défaut, d’autres matrices pour l’extraction du cortisol sont nécessaires. Chez les poissons, les matrices alternatives peuvent inclure la mâchoire, un tissu dur similaire à la dent humaine10.

Le développement de nouvelles matrices et de techniques validées pour déterminer les niveaux de stress des poissons est particulièrement intéressant pour l’industrie du caviar, où l’esturgeon peut être exposé de façon prolongée aux facteurs de stress environnemental11. Le sexe de l’esturgeon ne peut pas être déterminé avant l’âge de 2 ans, et l’esturgeon n’a pas d’écailles. Parce que le cortisol s’accumule progressivement en matrices solides au cours du stade de croissance2,7,12, les données d’accumulation de cortisol à long terme à partir de matrices dures telles que les nageoires et les mâchoires pourraient fournir un aperçu du stress à différents stades de croissance. En revanche, les niveaux de cortisol sanguin fournissent un instantané des niveaux de stress au moment du décès et ne peuvent pas représenter avec précision le stress pendant les conditions d’élevage à long terme13,14. Avec la concurrence croissante sur le marché du caviar, de nouvelles approches visant à améliorer les conditions de stress pour la production d’œufs plus sains chez les espèces d’esturgeons pendant l’élevage à long terme (8-12 ans ou plus) sont un domaine de recherche de plus en plus important. En raison du coût élevé de l’esturgeon, les échantillons récoltés sont extrêmement coûteux (8 000 $ à 15 000 $ par poisson mature selon l’espèce et le stade de croissance), un facteur limitant pour les projets de recherche. Cependant, le développement d’une technique appropriée pour l’extraction du cortisol à partir des nageoires et des mâchoires d’esturgeon pourrait être utilement appliqué à la fois aux systèmes de pisciculture et aux poissons sauvages afin d’améliorer la qualité et la récolte des œufs d’esturgeon pour la consommation et préservation.

En plus de fournir des résultats fiables6, la sélection d’une technique appropriée d’extraction de cortisol est d’une importance cruciale pour s’assurer que d’autres composés présents dans la matrice pendant la préparation de l’échantillon ne confondent pas la sortie, ce qui pourrait conduire à résultats incohérents. Il est également important de déterminer si les niveaux de cortisol des nageoires et de la mâchoire sont influencés par les niveaux d’hormones dans l’eau environnante. Heimbârge et coll.15 ont suggéré qu’un certain nombre de facteurs peuvent influencer les niveaux de cortisol, y compris l’âge, le sexe, la grossesse, la saison, la couleur12, et la région du corps à partir de laquelle le cortisol est extrait16. Cependant, peu d’informations sont disponibles sur les effets du lavage des solvants sur l’extraction de cortisol dans les matrices de corps de poisson8, et aucun sur ces effets chez l’esturgeon, à l’exception des œufs d’esturgeon17.

Bien que l’analyse des niveaux de cortisol de base des nageoires et des mâchoires de l’esturgeon exige que le poisson soit euthanasié, cette approche n’implique pas les techniques invasives requises pour l’échantillonnage sanguin chez les esturgeons vivants. Les échantillons de nageoires et d’os de mâchoire sont facilement prélevés, et l’extraction de ces tissus peut être effectuée rapidement. De même, l’extraction et l’analyse hormonales sont simples et nécessitent peu d’équipement spécialisé.

Dans cette étude, nous présentons une technique nouvelle et facilement appliquée pour l’extraction, le lavage et la détermination du cortisol à partir des nageoires et des mâchoires de poisson, dans le but de déterminer si les niveaux de cortisol mesurés à partir de ces matrices peuvent être utilisés de façon fiable comme stress Indicateurs. Les avantages de cette technique comprennent une approche facile et non invasive8, moins de variation des données, et une production fiable1,6,8,17; la technique s’applique aux espèces de poissons sans écailles telles que l’esturgeon. La technique nécessite l’abattage du poisson, la sélection des solvants de lavage appropriés2,4, broyage approprié des échantillons3,5, essai immunosorbent enzymatique professionnel (ELISA) application5,7, et une connaissance approfondie de l’incorporation des sources de cortisol en matrices solides6.

Nous avons appliqué deux solvants de lavage différents (eau ultrapure et isopropanol) pour obtenir des niveaux baso-bas de cortisol dans les nageoires de trois espèces d’esturgeons : le béluga (Huso huso),sibérien (Acipenser baerii),et le sevruga (A. stellatus ), dans des conditions environnementales standard pour chaque espèce. Des mâchoires de H. huso ont également été employées pour évaluer le stress dans l’esturgeon. Il s’agit de la première étude à mesurer les niveaux de cortisol dans les mâchoires d’esturgeon. Les résultats de cette étude fourniront des données comparatives sur le cortisol pour les espèces d’esturgeons au stade de croissance précoce (1 an) avant la détermination du sexe.

Protocol

Les procédures et méthodes expérimentales suivantes ont été approuvées par l’Autorité de bien-être et d’éthique des animaux de l’Université nationale de Kangwon, à Chuncheon, en République de Corée. 1. Collection Fin Capturez l’esturgeon doucement à l’aide d’un filet pour minimiser les blessures et le stress. Rincer soigneusement le poisson avec de l’eau douce, puis essuyer la surface du corps avec une serviette absorbante avant l’euthanasie. Frapper…

Representative Results

La technique présentée d’extraction de cortisol de nageoire a été développée et confirmée dans cette étude utilisant trois espèces d’esturgeon. Les niveaux de cortisol obtenus à l’aide d’eau ultrapure et d’isopropanol comme solvants de lavage ont été comparés (figure 2). Le cortisol des mâchoires de H. huso a été examiné pour déterminer si les mâchoires d’esturgeon pourraient être employées comme matrice alternative aux nageoires…

Discussion

L’esturgeon est parfois appelé un « fossile vivant » parce qu’il a exposé peu d’adaptations au cours des derniers millénaires. Le genre esturgeon Acipenser contient 27 espèces qui produisent du caviar; cependant, trois espèces (beluga, baerii et sevruga) produisent la majeure partie de l’approvisionnement mondial en caviar. Les esturgeons sont vulnérables à la surpêche et à l’interférence dans leur habitat naturel et sont donc plus en danger critique d’extinction que tout autre groupe d’espèces. L’e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été mené à l’appui du Programme de recherche coopérative pour les sciences agricoles et le développement de la technologie (titre du projet : Analyse du changement de productivité du bétail avec changement climatique, Projet no. PJ012771), Rural Development Administration, République de Corée. En outre, cette étude a été soutenue par une subvention (No. PJ01344604) de l’équipe de nutrition et de physiologie animales, National Institute of Animal Science, RDA, Séoul, République de Corée. Les auteurs remercient le PDG de Persian Gesture, Mohammad Hassan Salmanzadeh, et son équipe, qui ont fourni des poissons des trois espèces d’esturgeons examinées dans cette étude.

Materials

Disposal latex surgical gloves Ansell 63754090
Platform scale-electronic weighing 100kg Baskoolnikoo 101 EM
Serological pipette to deliver up to 24 mL Becton Dickinson Falcon 35-7550
Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters BioTek 8041000
Reagent reservoirs BrandTech 703459
Zipper storage plastic bag  Cleanwrap 30cm x100m
Isopropyl alcohol Daejung chemicals & Metals  5035-4400
Methyl alcohol Daejung chemicals & Metals  5558-4100
Tube rotator- MX-RL-Pro DLAB Scientific  824-222217777
Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL Eppendorf Research Plus M21518D
  Precision pipette to deliver 15 and 25 μL Eppendorf Research Plus R25623C
Weighing paper (107 x 210 mm) Fisherbrand 09-898-12B
Bead beater, 50/60 Hz 2A GeneReach Biotechnology Corp tp0088
Plate rotator with orbit capable of 500 rpm Hangzhou Miu Instrument  MU-E30-1044
Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL Hyundai Micro  H20050
Fume hood Kwang Dong Industrial KD 901-22128175
Micro-centrifuge capable of 1500 x g Labo Gene  9.900.900.729
Mini vortex mixer LMS VTX-3000L 
Lotte aluminum foil roll  Lotte Aluminum B0722X5FK5
Digital scale Mettler Toledo   ME204
Ultrapure water MDM MDM-0110
Pipette tips Neptune Scientific REF 2100.N
Large fish net Pond H2O Hoz135 
Salivary cortisol kit Salimetrics 1-3002-4
Bone cutting forceps Sankyo 26-188A
Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL VITLAB 18A68756
Towel Yuhan Kimberly 1707921546
Tissue paper (107 × 210) Yuhan Kimberly 41117

References

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Cite This Article
Ghassemi Nejad, J., Ataallahi, M., Salmanzadeh, M. H., Park, K. T., Lee, H. G., Shoae, A., Rahimi, A., Sung, K. I., Park, K. H. Cortisol Extraction from Sturgeon Fin and Jawbone Matrices. J. Vis. Exp. (151), e59961, doi:10.3791/59961 (2019).

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