Method Article

철갑상어 지느러미와 턱뼈 매트릭스에서 코티솔 추출

DOI:

10.3791/59961

⸱

September 10th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Animal Life Sciences, Kangwon National University, 2Team of An Educational Program for Specialists in Global Animal Science, Brain Korea 21 Plus Project, Konkuk University, 3Persian Gesture, 4Department of Animal Science and Technology, College of Animal Bioscience and Technology, Konkuk University, 5Department of Animal Science, Animal Physiology, AgResearch, 6Faculty of Agriculture, Animal Science Department, Ferdowsi University of Mashhad

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구에서는, 우리는 철갑상어 종의 지느러미와 턱뼈에서 코티솔 추출을 위한 프로토콜을 제시합니다. 지느러미와 턱뼈 코티솔 수준은 ELISA 검소에 선행된 2개의 세척 용매를 비교하여 더 조사되었습니다. 이 연구는 새로운 스트레스 지표로 턱뼈 코티솔의 타당성을 시험.

Abstract

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이 연구의 목적은 두 개의 세척 용매 (물과 이소 프로판올)를 사용하여 철갑상어 지느러미에서 코티솔을 추출하는 기술을 개발하고 세 가지 주요 외과 의사 종 중 지느러미 코티솔 수준의 차이를 정량화하는 것입니다. 지느러미는 벨루가7개(후소후소),시베리아 7개(아시펜서바에리이),세브루가 5개(A.stellatus)등 19척의 희생된 철갑상어에서 수확되었다. 철갑상어는 이란 농장에서 2년(2017-2018년)에 자랐으며, 코티솔 추출 분석은 한국에서(2019년 1월~2월) 실시되었습니다. 5 H. 후소에서 턱뼈는 또한 코티솔 추출에 사용되었다. 데이터는 SAS 환경에서 의 일반 선형 모델(GLM) 프로시저를 사용하여 분석하였다. 변이의 인트라-및 인터-분석 계수는 각각 14.15 및 7.70이었다. 간단히, 코티솔 추출 기술은 용매 (초순수 및 이소프로판올)의 3 mL로 시료 (300 ± 10 mg)를 두 번 세척하고, 80rpm에서 2.5 분 동안 회전하고, 7 일 동안 실온 (22-28 °C)에서 세척 된 샘플을 공기 건조하고, 추가 건조를 포함했습니다. 50 Hz에서 비드 비터를 사용하여 32 분 동안 시료를 분말로 분쇄하고 건조 된 분말 (75 ± 5 mg)에 1.5 mL 메탄올을 적용하고, 연속 혼합으로 실온에서 18 시간 동안 느린 회전 (40 rpm)을 적용합니다. 추출 후, 샘플을 원심분리(10분 동안 9,500 x g)하고, 1 mL 상급제를 새로운 미세원심지 튜브(1.5 mL)로 옮겼고, 메탄올을 증발시키기 위해 38°C에서 배양하고, 효소 연계 면역흡착 분석(ELISA)을 통해 분석하였다. . 종 사이 핀 코 티 솔 수준에서 또는 세척 용매 사이 지 느 러 미와 턱뼈 코 티 솔 수준에서 차이가 관찰 되었다. 이 연구의 결과는 철갑상어 턱뼈 매트릭스가 단단한 행렬에 유망한 대체 응력 지표이다는 것을 보여줍니다.

Introduction

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코티솔은 동물의 스트레스를 신뢰할 수 있는 지표입니다. 코 티 솔 추출 스트레스 수준에 스트레스 수준 및 일반적인 패턴을 모니터링 하는 연구원에 대 한 유효한 프레임 워크를 제공 합니다. 예를 들어, 이전 연구는 인간1,2,원숭이3,4,가축5,양6,및 다양한 방법을 사용하여 모발 코티솔 측정의 방법론적 검증을 수행하였다. 금붕어7,8. 물고기 종에서, 비늘 등 매트릭스에서 코 티 솔 측정, 피부 점액, 대변, 그리고 혈액9 물고기 건강에 대 한 정보를 제공 하기 위해 표시 되었습니다. 혈액 샘플링이 문제가 있거나 비늘이 부족할 때, 코티솔 추출을 위한 대체 매트릭스가 필요합니다. 물고기에서, 대체 행렬은 턱뼈, 인간의 치아와 유사한 단단한 조직을 포함할 수있다(10).

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Protocol

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다음 실험 절차와 방법은 강원대학교 춘천대학교 동물복지윤리청의 승인을 받았습니다.

1. 핀 컬렉션

  1. 그물을 사용하여 철갑상어를 부드럽게 캡처하여 부상과 스트레스를 최소화하십시오.
  2. 생선을 깨끗한 물로 조심스럽게 헹구고 안락사 전에 흡수성 수건으로 몸 표면을 닦아냅니다.
  3. 물고기가 기절하거나 의식을 잃게되도록 플라스틱 망치를 사용하여 물고기의 머리를 명중. 칼을 사용하여 머리를 제거합니다.
  4. 체중(g)과 길이(cm)를 측정합니다.
  5. 안락사 후, 멸균 수술 가위를 사용하여 가능한 한 몸에 가깝게 절단하여 지느러미 샘플을 수집합니다.
    참고: 각 생선에 대해 재활용되지 않은 흡수성 수건을 사용해야 합니다. 본 연구에서 사용된 종에 대한 설명 통계는 다음과 같다: 벨루가 철갑상어(H. huso):연령 = 18±2.1 개월, 체중 = 2,700±300 g, 및 체길이 = 55±5 cm; 시베리아철갑상어(A. baerii):나이 = 9.6±2.4개월, 체중 = 1,750±250 g, 및 체길이 = 45±5 cm; 세브루가 철갑상어(A. 스텔라투스):나이 = 14 ± 1.3 개월, 체중 = 1,000 ± 100g, 몸 길이 ....

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Results

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제시된 지느러미 코티솔 추출 기술은 3개의 철갑상어 종을 사용하여 이 연구에서 개발되고 확인되었습니다. 세척 용매로서 초순수 및 이소프로판올을 사용하여 얻은 코티솔 수준을 비교하였다(도2). H. huso 턱뼈에서 코티솔은 철갑상어 턱뼈가 지느러미에 대한 대체 매트릭스로 사용될 수 있는지 여부를 결정하기 위해 검사되었습니다. 세척 용매, 철갑상어 종 및 이들의 상호 작용의 효과는 표 1에나타내있습니다. 코티솔 수준은 물로 세척한 것보다 이소프로판올로 세척된 핀 샘플에서 더 높은 경향이 있었다(p = 0.089). 철갑상어 종 중 지느러미 코티솔 수준 (p = 0.525)에는 유의한 차이가 없었습니다. 세척 용매와 철갑상어 종 사이에 유의한 상호 작용이 없었다 (p = 0.947). 세척 용매는 H. 후소 외과 (p = 0.45)에서 코티솔 수준에 유의한 영.......

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Discussion

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철갑상어는 지난 천년 동안 몇 가지 적응을 전시했기 때문에 때때로 "살아있는 화석"이라고합니다. 철갑상어 속 Acipenser는 캐비어를 생산하는 27 종을 포함; 그러나, 세 종 (벨루가, baerii, 세브루가) 글로벌 캐비어 공급의 대부분을 생산하고 있습니다. 철갑상어는 자연 서식지에서 의 외낚시와 간섭에 취약하기 때문에 다른 어떤 종보다도 더 심각한 멸종 위기에 처해 있습니다. 철갑상어는 1억 5천만 년 동안 존재해 온 가장 오래된 살아있는 척추동물 그룹에 속합니다. Acipenser 종 성숙 하 고 천천히 성장; 일부 (예를 들어, H. huso)100 년 동안 살 수 있고 무게2,000kg을 초과할 수 있습니다. 철갑상어는 비늘이 없는 연골 물고기이며, 입 앞에 있는 스큐와 촉각 바벨이라고 불리는 5열의 큰 뼈판이특징입니다(그림 1). 이 종과 그밖 물고기 사이 생리적인 다름은 환경 스트레스에 감소된 플라즈마 (코르티.......

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Disclosures

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저자는 공개할 이해상충이 없습니다.

Acknowledgements

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이 사업은 농업과학기술개발협력연구프로그램(프로젝트제목: 기후변화에 의한 축산생산성변화분석, 프로젝트번호)의 지원으로 진행되었다. PJ012771), 한국 농촌진흥청. 또한, 이 연구는 보조금에 의해 지원되었다 (아니오. PJ01344604) 동물영양생리학과, 국립동물과학원, RDA, 서울, 대한민국. 저자는 감사페르시아 제스처 CEO 모하마드 하산 살만자데와 그의 팀을 인정, 누가이 연구에서 검사 세 철갑상어 종에서 물고기를 제공.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
폐기 라텍스 수술용 장갑Ansell63754090
플랫폼 저울-전자 중량 측정 100kgBaskoolnikoo101 EM
최대 24mLBecton Dickinson Falcon35-7550
마이크로 플레이트 리더(450nm 및 490 - 492nm 기준 필터 포함BioTek8041000
시약 저장 용액BrandTech703459
지퍼 보관 비닐 봉지 Cleanwrap30cm x100m
이소프로필알코올대정화학& 금속 5035-4400
메틸알코올대정화학공업 금속 5558-4100
튜브 로테이터- MX-RL-ProDLAB Scientific 824-222217777
1.5 및 10 mLEppendorf Research PlusM21518D
  15 및 25 &mu를 전달하는 정밀 피펫; LEppendorf Research PlusR25623C
계량지 (107 x 210 mm)Fisherbrand09-898-12B
비드 비터, 50/60 Hz 2AGeneReach Biotechnology Corptp0088
500 rpm 궤도 가능한 플레이트 로테이터Hangzhou Miu Instrument MU-E30-1044
일회용 폴리프로필렌 튜브는 최소 24 mL를 수용할 수 있습니다마이크로 H20050
연기 후드Kwang Dong IndustrialKD 901-22128175
1500 x g Labo Gene이 가능한 마이크로 원심분리기; 9.900.900.729
미니 소용돌이 믹서LMSVTX-3000L 
롯데 알루미늄 호일 롤 롯데 알루미늄B0722X5FK5
디지털 스케일메틀러 톨레도   ME204
초순수MDMMDM-0110
피펫 팁Neptune ScientificREF 2100.N
대형 어망연못 H2OHoz135 
타액 코르티솔 키트Salimetrics1-3002-4
뼈 절단 펜치Sankyo26-188A
정밀 다채널 피펫으로 50 μ L 및 200 μ LVITLAB18A68756
수건Yuhan Kimberly1707921546
티슈 페이퍼 (107 × 210)Yuhan Kimberly41117
) 를 제공하는 정밀 피펫. 현대

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meyer, J. S., Novak, M. A. Hair cortisol: a novel biomarker of hypothalamic-pituitary- adrenocortical activity. Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).
  2. Ghassemi Nejad, J., et al. A cortisol study: facial hair and nails. Journal of Steroids Hormonal S....

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