स्टर्जन फिन और जबड़े की हड्डी मैट्रिक्स से Cortisol निष्कर्षण
Summary
इस अध्ययन में, हम स्टर्जन प्रजातियों के पंख और जबड़े की हड्डी से कोर्टिसोल निष्कर्षण के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। फिन और जबड़े की हड्डी कोर्टिसोल के स्तर को आगे दो धोने सॉल्वैंट्स की तुलना के बाद एलिसा परख द्वारा जांच की गई. इस अध्ययन में एक उपन्यास तनाव सूचक के रूप में जबड़े की हड्डी कोर्टिसोल की व्यवहार्यता पायलट.
Abstract
इस अध्ययन का उद्देश्य दो धोने सॉल्वैंट्स (पानी और आइसोप्रोपेनोल) का उपयोग कर के स्टर्जन पंख से कोर्टिसोल की निकासी के लिए एक तकनीक विकसित करने और तीन मुख्य स्टर्जन प्रजातियों के बीच फिन कोर्टिसोल के स्तर में किसी भी मतभेद की मात्रा निर्धारित करने के लिए थे। फिन्स को 19 बलिदान स्टर्जनों से काटा गया था , जिनमें सात बेलुगा (हुसो हसो), सात साइबेरियाई (एसिपेन्सर बैरी) और पांच सेवरूगा (ए स्टेलेटस) शामिल थे . Sturgeons 2 साल (2017-2018) के लिए ईरानी खेतों में उठाए गए थे, और कोर्टिसोल निष्कर्षण विश्लेषण दक्षिण कोरिया में आयोजित किया गया (जनवरी-फरवरी 2019). कोर्टिसोल निष्कर्षण के लिए पांच एच हूसो से जबड़े की हड्डी का भी उपयोग किया गया था। डेटा SAS वातावरण में सामान्य रेखीय मॉडल (GLM) प्रक्रिया का उपयोग कर विश्लेषण किया गया। अंतर-एवं अंतर-आस्पर गुणांक क्रमशः 14.15 और 7.70 थे। संक्षेप में, कोर्टिसोल निष्कर्षण तकनीक में 3 एमएल विलायक (अल्ट्रापुरे पानी और आइसोप्रोपेनोल) के साथ नमूने (300 डिग्री 10 मिलीग्राम) को धोने में दो बार, 2.5 मिनट के लिए 80 आरपीएम पर रोटेशन, कमरे के तापमान पर धोया गया नमूनों को हवा में सुखाने (22-28 डिग्री सेल्सियस) 7 दिनों के लिए, आगे सुखाने के लिए 32 मिनट के लिए 50 हर्ट्ज पर एक मनका beater का उपयोग कर नमूने और उन्हें पाउडर में पीस, सूखे पाउडर के लिए 1.5 एमएल मेथनॉल लागू करने (75 डिग्री 5 मिलीग्राम), और धीमी गति से रोटेशन (40 rpm) के लिए 18 एच लगातार मिश्रण के साथ कमरे के तापमान पर. निष्कर्षण के बाद, नमूनों को सेंट्रीफ्यूड (9,500 x ग्राम 10 मिनट के लिए) किया गया था, और 1 एमएल सुपरनेट को एक नए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब (1.5 एमएल) में स्थानांतरित किया गया था, मेथनॉल को वाष्पित करने के लिए 38 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया था, और एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसमोरबेंट परख (एलिसा) के माध्यम से विश्लेषण किया गया था। . प्रजातियों के बीच फिन कोर्टिसोल के स्तर में या धोने सॉल्वैंट्स के बीच फिन और जबड़े की हड्डी कोर्टिसोल के स्तर में कोई अंतर नहीं देखा गया। इस अध्ययन के परिणामों से पता चलता है कि स्टर्जन जबड़े की हड्डी मैट्रिक्स ठोस matrices के लिए एक आशाजनक वैकल्पिक तनाव सूचक है.
Introduction
Cortisol पशु तनाव का एक विश्वसनीय सूचक है. Cortisol निष्कर्षण शोधकर्ताओं तनाव के स्तर और तनाव में सामान्य पैटर्न पर नजर रखने के लिए एक वैध रूपरेखा प्रदान करता है. उदाहरण के लिए, पिछले अध्ययनों से मनुष्य में विभिन्न विधियों का उपयोग करते हुए बाल कोर्टिसोल माप का पद्धतिसत्यापन किया गयाहै 1,2, बंदर3,4, पशु5, भेड़6, और सुनहरी मछली7,8. मछली प्रजातियों में, तराजू, त्वचा बलगम, मल, और रक्त9 जैसे matrices में कोर्टिसोल माप मछली स्वास्थ्य के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए दिखाया गया है। जब रक्त नमूने समस्याग्रस्त है या तराजू की कमी है, कोर्टिसोल निष्कर्षण के लिए वैकल्पिक matrices की जरूरत है. मछली में, वैकल्पिक matrices जबड़े की हड्डी, मानव दांत10के समान एक कठिन ऊतक शामिल कर सकते हैं.
मछली तनाव के स्तर को निर्धारित करने के लिए नई matrices और मान्य तकनीकों का विकास कैवियार उद्योग के लिए विशेष रुचि का है, जहां स्टर्जन पर्यावरण तनाव कारकों11के लिए लंबे समय तक जोखिम का अनुभव कर सकते हैं। स्टर्जन का लिंग 2 साल की उम्र से पहले निर्धारित नहीं किया जा सकता है, और स्टर्जन के पास तराजू नहीं होते हैं। क्योंकि कोर्टिसोल धीरे-धीरे विकास चरण के दौरान ठोस matrices में जमा हो जाता है2,7,12, लंबी अवधि कोर्टिसोल संचय डेटा हार्ड matrices से इस तरह के पंख और जबड़े की हड्डी के रूप में तनाव में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है विभिन्न विकास चरणों में स्तर। इसके विपरीत, रक्त कोर्टिसोल स्तर मृत्यु के समय तनाव के स्तर का एक स्नैपशॉट प्रदान करते हैं और दीर्घकालिक पालन स्थितियों13,14के दौरान तनाव का सही प्रतिनिधित्व नहीं कर सकते. कैवियार बाजार में बढ़ती प्रतिस्पर्धा के साथ, दीर्घकालिक पालन (8-12 वर्ष या उससे अधिक) के दौरान स्टर्जन प्रजातियों के बीच स्वस्थ अंडे के उत्पादन के लिए तनाव की स्थिति में सुधार करने के लिए नए दृष्टिकोण अनुसंधान के एक तेजी से महत्वपूर्ण क्षेत्र हैं। स्टर्जन की उच्च लागत के कारण, काटा नमूने बहुत महंगा कर रहे हैं (8,000-15,000 प्रति परिपक्व मछली प्रजातियों और विकास के चरण के आधार पर), अनुसंधान परियोजनाओं के लिए एक सीमित कारक. हालांकि, स्टर्जन पंख और जबड़े की हड्डी से कोर्टिसोल निष्कर्षण के लिए एक उपयुक्त तकनीक के विकास उपयोगी दोनों मछली खेती प्रणालियों के लिए और जंगली मछली में दोनों की खपत के लिए स्टर्जन अंडे की गुणवत्ता और फसल में सुधार करने के लिए लागू किया जा सकता है और संरक्षण.
के रूप में अच्छी तरह से विश्वसनीय परिणाम प्रदान करने के रूप में6, एक उपयुक्त कोर्टिसोल निष्कर्षण तकनीक का चयन महत्वपूर्ण महत्व का है यह सुनिश्चित करने के लिए कि नमूना तैयारी के दौरान मैट्रिक्स में मौजूद अन्य यौगिकों उत्पादन उलझन में नहीं है, जो करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं असंगत परिणाम. यह निर्धारित करने के लिए समान रूप से महत्वपूर्ण है कि क्या फिन और जबड़े की हड्डी कोर्टिसोल का स्तर आसपास के पानी में हार्मोन के स्तर से प्रभावित हैं। Heimb-rge एट अल.15 सुझाव दिया है कि कारकों की एक संख्या उम्र, लिंग, गर्भावस्था, मौसम, रंग12,और शरीर क्षेत्र जिसमें से कोर्टिसोल निकाला जाता है सहित कोर्टिसोल के स्तर को प्रभावित कर सकते हैं16. हालांकि, मछली शरीर matrices में कोर्टिसोल निष्कर्षण पर सॉल्वैंट्स धोने के प्रभाव पर कम जानकारी उपलब्ध है8, और स्टर्जन अंडे17के अलावा स्टर्जन में इन प्रभावों पर कोई भी .
हालांकि पंख और स्टर्जन के जबड़े की हड्डी से आधारभूत कोर्टिसोल के स्तर का विश्लेषण करने की आवश्यकता है कि मछली ethanized किया जा, इस दृष्टिकोण आक्रामक तकनीक लाइव स्टर्जन में रक्त नमूने के लिए आवश्यक जरूरत नहीं है. फिन और जबड़े की हड्डी के नमूने आसानी से एकत्र किए जाते हैं, और इन ऊतकों से निष्कर्षण तेजी से किया जा सकता है। इसी तरह, हार्मोन निष्कर्षण और विश्लेषण सीधा कर रहे हैं और थोड़ा विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है.
इस अध्ययन में, हम निष्कर्षण के लिए एक नई और आसानी से लागू तकनीक प्रस्तुत, धोने, और मछली पंख और जबड़े की हड्डी से कोर्टिसोल के निर्धारण, निर्धारित करने के उद्देश्य के साथ कि क्या कोर्टिसोल स्तर इन matrices से मापा मज़बूती से तनाव के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है संकेतक. इस तकनीक के फायदे एक आसान और गैर इनवेसिव8 दृष्टिकोण, कम डेटा भिन्नता , और विश्वसनीय उत्पादन1,6,8,17शामिल हैं; तकनीक ऐसे स्टर्जन के रूप में तराजू के बिना मछली प्रजातियों के लिए लागू है. इस तकनीक के लिए मछली के वध की आवश्यकता होती है, उचित वाशिंग सॉल्वैंट्स2,4,नमूनोंकी उचित पीस3 ,5,पेशेवर एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोर्बेंट परख (एलिसा) का चयन आवेदन5,7, और ठोस matrices6में कोर्टिसोल स्रोतों के समावेश का व्यापक ज्ञान .
हमने तीन स्टर्जन प्रजातियों से पंख में बेसल कोर्टिसोल स्तर प्राप्त करने के लिए दो अलग-अलग वाशिंग सॉल्वैंट्स (अल्ट्रापुरे पानी और आइसोप्रोपेनोल) लागू किए हैं: बेलुगा (हुसो हूसो), साइबेरियाई (एकिसपेन्सर बेरीई), और सेवरूगा (ए. स्टेलेटस) ), प्रत्येक प्रजाति के लिए मानक पर्यावरण की स्थिति के तहत. स्टर्जन में तनाव का मूल्यांकन करने के लिए एच हूसो के जबड़े की हड्डी का भी उपयोग किया गया था। स्टर्जन जबड़े की हड्डी में कोर्टिसोल के स्तर को मापने के लिए यह पहला अध्ययन है। इस अध्ययन के परिणाम सेक्स निर्धारण से पहले प्रारंभिक विकास चरण (1 वर्ष) में स्टर्जन प्रजातियों के लिए तुलनात्मक कोर्टिसोल डेटा प्रदान करेंगे।
Protocol
Representative Results
Discussion
Sturgeon कभी कभी एक “जीवित जीवाश्म” कहा जाता है क्योंकि यह पिछले सदियों भर में कुछ रूपांतरों का प्रदर्शन किया है. स्टर्जन जीनस एकिपेन्सर में 27 प्रजातियां होती हैं जो कैवियार का उत्पादन करती हैं; हालांकि, त?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम कृषि विज्ञान और प्रौद्योगिकी विकास के लिए सहकारी अनुसंधान कार्यक्रम के समर्थन के साथ आयोजित किया गया (परियोजना शीर्षक: पशुधन उत्पादकता परिवर्तन जलवायु परिवर्तन के साथ विश्लेषण, परियोजना नहीं. PJ012771), ग्रामीण विकास प्रशासन, कोरिया गणराज्य. इसके अलावा, इस अध्ययन के एक अनुदान द्वारा समर्थित था (नहीं. पशु पोषण और शरीर विज्ञान टीम, राष्ट्रीय पशु विज्ञान संस्थान, आरडीए, सियोल, कोरिया गणराज्य से PJ01344604)। लेखकों ने फारसी इशारे के मुख्य कार्यकारी अधिकारी मोहम्मद हसन सलमानजादे और उनकी टीम को आभारी ताक पर रखा, जिन्होंने इस अध्ययन में जांची गई तीन स्टर्जन प्रजातियों से मछली उपलब्ध कराई थी।
Materials
| Disposal latex surgical gloves | Ansell | 63754090 |
| Platform scale-electronic weighing 100kg | Baskoolnikoo | 101 EM |
| Serological pipette to deliver up to 24 mL | Becton Dickinson Falcon | 35-7550 |
| Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters | BioTek | 8041000 |
| Reagent reservoirs | BrandTech | 703459 |
| Zipper storage plastic bag | Cleanwrap | 30cm x100m |
| Isopropyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5035-4400 |
| Methyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5558-4100 |
| Tube rotator- MX-RL-Pro | DLAB Scientific | 824-222217777 |
| Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL | Eppendorf Research Plus | M21518D |
| Precision pipette to deliver 15 and 25 μL | Eppendorf Research Plus | R25623C |
| Weighing paper (107 x 210 mm) | Fisherbrand | 09-898-12B |
| Bead beater, 50/60 Hz 2A | GeneReach Biotechnology Corp | tp0088 |
| Plate rotator with orbit capable of 500 rpm | Hangzhou Miu Instrument | MU-E30-1044 |
| Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL | Hyundai Micro | H20050 |
| Fume hood | Kwang Dong Industrial | KD 901-22128175 |
| Micro-centrifuge capable of 1500 x g | Labo Gene | 9.900.900.729 |
| Mini vortex mixer | LMS | VTX-3000L |
| Lotte aluminum foil roll | Lotte Aluminum | B0722X5FK5 |
| Digital scale | Mettler Toledo | ME204 |
| Ultrapure water | MDM | MDM-0110 |
| Pipette tips | Neptune Scientific | REF 2100.N |
| Large fish net | Pond H2O | Hoz135 |
| Salivary cortisol kit | Salimetrics | 1-3002-4 |
| Bone cutting forceps | Sankyo | 26-188A |
| Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL | VITLAB | 18A68756 |
| Towel | Yuhan Kimberly | 1707921546 |
| Tissue paper (107 × 210) | Yuhan Kimberly | 41117 |
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