チョウザメフィンと顎骨マトリックスからのコルチゾール抽出
Summary
本研究では、チョウザメ種のフィンと顎骨からのコルチゾール抽出のためのプロトコルを提示する。フィンと顎骨コルチゾールレベルは、ELISAアッセイに続く2つの洗浄溶媒を比較することによってさらに調べた。本研究は、新しいストレス指標として顎骨コルチゾールの実現可能性を試験的に実施した。
Abstract
本研究の目的は、2つの洗浄溶媒(水とイソプロパノール)を用いてチョウザメのひれからコルチゾールを抽出する技術を開発し、3つの主要チョウザメ種間のフィンコルチゾールレベルの違いを定量化することを目的とした。フィンは、7匹のベルーガ(フーソ)、7シベリア(アシペンサー・バエリ)、5匹のセブルガ(A.ステラタス)を含む19匹の犠牲チョウザメから収穫された。チョウザメはイランの農場で2年間(2017~2018年)飼育され、韓国(2019年1月~2月)でコルチゾール抽出分析を行いました。5 H. husoからの顎骨もコルチゾール抽出に使用された。データは、SAS 環境の一般的な線形モデル (GLM) 手順を使用して分析されました。変動のアッセイ内係数とアッセイ間係数はそれぞれ14.15と7.70であった。簡単に言えば、コルチゾール抽出技術は、サンプル(300±10mg)を3mLの溶媒(超純水およびイソプロパノール)で2回洗浄し、80rpmで2.5分間回転させ、洗浄したサンプルを室温(22-28°C)で7日間空気乾燥し、さらに乾燥させた。50Hzでビーズビーターを32分間使用し、粉末に粉砕し、乾燥粉末(75±5mg)に1.5mLメタノールを塗布し、連続混合で室温で18時間のスロー回転(40rpm)を行います。抽出後、サンプルを遠心分離(9,500 x g 10分)、1mL上清を新しいマイクロ遠心管(1.5mL)に移し、38°Cでインキュベートしてメタノールを蒸発させ、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を介して分析した。.種間のフィンコルチゾールレベル、または洗浄溶媒間のフィンおよび顎骨コルチゾールレベルに差は認められなかった。本研究の結果は、チョウザメの顎骨マトリックスが固体行列に対する有望な代替応力指標であることを示している。
Introduction
コルチゾールは、動物のストレスの信頼性の高い指標.コルチゾール抽出は、ストレスレベルとストレスの一般的なパターンを監視する研究者のための有効なフレームワークを提供します。例えば、これまでの研究では、ヒト1、2、サル3、4、牛5、羊6、および様々な方法を用いて毛髪コルチゾール測定の方法論的検証を行った。金魚7,8.魚種では、スケール、皮膚粘液、feces、血液9などのマトリックスにおけるコルチゾール測定が、魚の健康に関する情報を提供することが示されている。血液サンプリングが問題がある場合、またはスケールが不足している場合は、コルチゾール抽出のための代替行列が必要です。魚類において、代替行列は顎骨、ヒト歯10に類似した硬い組織を含むことができる。
魚のストレスレベルを決定するための新しい行列と検証された技術の開発は、チョウザメが環境ストレス因子11への長期暴露を経験することができるキャビア業界に特に関心があります。チョウザメの性別は2歳までには特定できず、チョウザメはスケールを持っていません。コルチゾールは成長段階2、7、12の間に固体マトリックスに徐々に蓄積するので、フィンや顎骨などの硬いマトリックスからの長期コルチゾール蓄積データは、ストレスに関する洞察を提供することができます異なる成長段階でレベル。対照的に、血液コルチゾールレベルは、死亡時のストレスレベルのスナップショットを提供し、長期的な飼育条件13,14の間にストレスを正確に表すことができない。キャビア市場での競争の激化に伴い、長期飼育(8~12年以上)のチョウザメ種間で健康な卵を生産するためのストレス条件を改善する新しいアプローチは、ますます重要な研究分野となっています。チョウザメのコストが高いため、収穫されたサンプルは非常に高価です(種や成長段階に応じて成熟した魚1匹につき$8,000-15,000)、研究プロジェクトの制限要因です。しかし、チョウザメのひれと顎骨からのコルチゾール抽出のための適切な技術の開発は、魚の養殖システムと野生の魚の両方に有用に適用することができ、消費のためのチョウザメの卵の品質と収穫を改善し、保全。
信頼性の高い結果6を提供するだけでなく、適切なコルチゾール抽出技術の選択は、サンプル調製中にマトリックス内に存在する他の化合物が出力を混同しないことを確実にするために非常に重要であり、一貫性のない結果です。フィンと顎骨コルチゾールレベルが周囲の水中のホルモンレベルの影響を受けるかどうかを決定することは同様に重要です.Heimbürge etal.15は、年齢、性別、妊娠、季節、色12、およびコルチゾールが抽出された身体領域を含む多くの因子がコルチゾールレベルに影響を与える可能性があることを示唆した。しかし、魚体マトリックス8におけるコルチゾール抽出に対する洗浄溶媒の影響に関する情報はほとんどなく、チョウザメの卵17を除くチョウザメにおけるこれらの効果に関する情報はほとんどない。
チョウザメのひれと顎骨からベースラインコルチゾールレベルを分析するには、魚を安楽死させる必要がありますが、このアプローチは生チョウザメの血液採取に必要な侵襲的な技術を伴いません。フィンおよび顎骨のサンプルは容易に集められ、これらのティッシュからの抽出は速く行うことができる。同様に、ホルモンの抽出と分析は簡単で、少し専門的な機器を必要とします。
本研究では、魚のひれや顎骨からのコルチゾールの抽出、洗浄、判定に関する新しい簡単に適用された技術を提示し、これらのマトリックスから測定されたコルチゾールレベルをストレスとして確実に使用できるかどうかを決定する目的で、指標。この技術の利点は、簡単で非侵襲的な8アプローチ、より少ないデータバリエーション、および信頼性の高い出力1、6、8、17が含まれます。この技術は、チョウザメのようなスケールのない魚種に適用可能である。この技術は、魚の屠殺、適切な洗浄溶媒の選択2、4、サンプル3、5、専門の酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)の適切な粉砕を必要とするアプリケーション5、7、および固体行列6へのコルチゾール源の組み込みに関する広範な知識。
ベルーガ(フーソ)、シベリア(アシペンサー・バエリ)、セブルガ(A.ステラタス)の3種からフィンの基礎コルチゾールレベルを得るために、2種類の洗浄溶剤(超純水とイソプロパノール)を塗布しました。)、各種の標準的な環境条件の下で。H.husoの顎骨はまた、チョウザメのストレスを評価するために使用されました。これはチョウザメの顎骨のコルチゾールレベルを測定する最初の研究です。本研究の結果は、性決定前の早期成長段階(~1年)におけるチョウザメ種の比較コルチゾールデータを提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
チョウザメは、過去数千年を通じてほとんど適応を示していないので、「生きた化石」と呼ばれることがあります。チョウザメ属アシペンサーは、キャビアを生産する27種が含まれています。しかし、3種(ベルーガ、バエリ、セブルガ)は、世界的なキャビア供給のほとんどを生産します。チョウザメは、自然の生息地で過剰漁業や干渉に対して脆弱であり、したがって、他のどの種の?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、農林水産技術開発協力研究プログラム(プロジェクトタイトル:気候変動に伴う家畜生産性変化分析、プロジェクトNo.PJ012771)、韓国農村開発局。また、この研究は助成金(いいえ)PJ01344604) 動物栄養生理学チーム、国立動物科学研究所、RDA、ソウル、韓国。著者らは、ペルシャのジェスチャーCEOモハマド・ハッサン・サルマンザデと彼のチームが、この研究で調べた3つのチョウザメ種から魚を提供したことを感謝しています。
Materials
| Disposal latex surgical gloves | Ansell | 63754090 |
| Platform scale-electronic weighing 100kg | Baskoolnikoo | 101 EM |
| Serological pipette to deliver up to 24 mL | Becton Dickinson Falcon | 35-7550 |
| Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters | BioTek | 8041000 |
| Reagent reservoirs | BrandTech | 703459 |
| Zipper storage plastic bag | Cleanwrap | 30cm x100m |
| Isopropyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5035-4400 |
| Methyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5558-4100 |
| Tube rotator- MX-RL-Pro | DLAB Scientific | 824-222217777 |
| Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL | Eppendorf Research Plus | M21518D |
| Precision pipette to deliver 15 and 25 μL | Eppendorf Research Plus | R25623C |
| Weighing paper (107 x 210 mm) | Fisherbrand | 09-898-12B |
| Bead beater, 50/60 Hz 2A | GeneReach Biotechnology Corp | tp0088 |
| Plate rotator with orbit capable of 500 rpm | Hangzhou Miu Instrument | MU-E30-1044 |
| Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL | Hyundai Micro | H20050 |
| Fume hood | Kwang Dong Industrial | KD 901-22128175 |
| Micro-centrifuge capable of 1500 x g | Labo Gene | 9.900.900.729 |
| Mini vortex mixer | LMS | VTX-3000L |
| Lotte aluminum foil roll | Lotte Aluminum | B0722X5FK5 |
| Digital scale | Mettler Toledo | ME204 |
| Ultrapure water | MDM | MDM-0110 |
| Pipette tips | Neptune Scientific | REF 2100.N |
| Large fish net | Pond H2O | Hoz135 |
| Salivary cortisol kit | Salimetrics | 1-3002-4 |
| Bone cutting forceps | Sankyo | 26-188A |
| Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL | VITLAB | 18A68756 |
| Towel | Yuhan Kimberly | 1707921546 |
| Tissue paper (107 × 210) | Yuhan Kimberly | 41117 |
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