Извлечение кортизола из осетровых плавников и челюстных матрис
Summary
В этом исследовании мы представляем протокол для извлечения кортизола из плавника и челюстной кости видов осетровых. Уровни фин и кортизола челюстной кости были дополнительно изучены путем сравнения двух стиральных растворителей, за которыми следуют анализы ELISA. Это исследование пилотировало осуществимость кортизола челюсти в качестве нового индикатора стресса.
Abstract
Целью данного исследования было разработать методику извлечения кортизола из осетровых плавников с использованием двух стиральных растворителей (вода и изопропанол) и количественно определить любые различия в уровнях фин кортизола между тремя основными видами осетровых. Фины были собраны из 19 жертвенных осетровых, включая семь белуги(Huso huso),семь сибирских (Acipenser baerii), и пять севруга (A. stellatus). Осетровые были выращены на иранских фермах в течение 2 лет (2017-2018 гг.), а анализ добычи кортизола проводился в Корее (январь-февраль 2019 года). Челюсти из пяти H. huso также использовались для извлечения кортизола. Данные анализировались с помощью общей процедуры линейной модели (GLM) в среде SAS. Коэффициенты вариации внутри- и меж-асса составили соответственно 14,15 и 7,70. Короче говоря, метод извлечения кортизола включал мытье образцов (300 и 10 мг) с 3 мл растворителя (ультрачистая вода и изопропанол) дважды, вращение при 80 об/мин в течение 2,5 мин, высыхание промытых образцов при комнатной температуре (22-28 градусов по Цельсию) в течение 7 дней, дальнейшую сушку образцы с использованием бисера бисера на 50 Гц в течение 32 минут и измельчения их в порошок, применяя 1,5 мл метанола к сушеным порошка (75 х 5 мг), и медленное вращение (40 об/мин) в течение 18 н.ч. при комнатной температуре с непрерывным смешиванием. После извлечения, образцы были центрифугированы (9500 х г в течение 10 мин), и 1 мл супернатанта был перенесен в новую микроцентрифугую трубку (1,5 мл), инкубировали при 38 градусах Цельсия, чтобы испарить метанол, и проанализированы с помощью фермента связанных иммуносорбент анализа (ELISA) . Никаких различий в уровнях кортизола фина среди видов или в плавники и челюстной кости кортизола уровнях между мытья растворителей. Результаты этого исследования показывают, что матрица челюстной кости осетровых является перспективным альтернативным индикатором стресса для твердых матриц.
Introduction
Кортизол является надежным индикатором стресса животных. Извлечение кортизола обеспечивает действительную основу для исследователей для мониторинга уровней стресса и общих закономерностей в стрессорах. Например, предыдущие исследования провели методологическую проверку измерений кортизола волос с использованием различных методов у людей1,2, обезьяны 3,4,крупного рогатого скота5,овец6,и золотая рыбка7,8. В видах рыб, кортизол измерения в матрицах, таких как весы, слизь кожи, кала, и кровь9 было показано, чтобы обеспечить информацию о здоровье рыбы. Когда отбор проб крови является проблематичным или весы отсутствуют, альтернативные матрицы для извлечения кортизола необходимы. В рыбе, альтернативные матрицы могут включать челюстную кость, твердую ткань, похожую на человеческий зуб10.
Разработка новых матриц и проверенных методов определения уровня стресса рыбы представляет особый интерес для икры промышленности, где осетр может испытывать длительное воздействие факторов экологического стресса11. Пол осетровых не может быть определен до 2 лет, а у осетровых нет чешуи. Потому что кортизол постепенно накапливается в твердых матриц во время стадии роста2,7,12, долгосрочные данные накопления кортизола из твердых матриц, таких как плавники и челюстные кости могут обеспечить понимание стресса на разных стадиях роста. В отличие от этого, уровни кортизола в крови обеспечивают снимок уровня стресса во время смерти и не может точно представлять стресс во время длительных условий воспитания13,14. С ростом конкуренции на рынке икры все более важной областью исследований становятся новые подходы к улучшению стрессовых условий для производства более здоровых яиц среди видов осетровых при длительном выращивании (8-12 лет и более лет). Из-за высокой стоимости осетровых, собранные образцы являются чрезвычайно дорогостоящими ($ 8000-15000 за взрослую рыбу в зависимости от видов и стадии роста), ограничивающим фактором для научно-исследовательских проектов. Однако разработка соответствующего метода извлечения кортизола из осетровых плавников и челюстных костей может быть с пользой применена как к системам рыбоводства, так и к дикой рыбе для улучшения качества и сбора осетровых яиц как для потребления, так и для потребления Сохранения.
Помимо предоставления надежных результатов6, выбор соответствующего метода извлечения кортизола имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы другие соединения, присутствующие в матрице во время подготовки образца, не смужают выход, что может привести к противоречивые результаты. Не менее важно определить, влияют ли уровень плавника и кортизола челюстной кости уровень гормонов в окружающей воде. Хаймбюрге и др.15 предположили, что ряд факторов может повлиять на уровень кортизола, включая возраст, пол, беременность, сезон, цвет12, и область тела, из которой кортизол извлекается16. Тем не менее, мало информации имеется о влиянии стирки растворителей на добычу кортизола в матрицах тела рыб8, и ни на эти эффекты у осетровых, за исключением осетровых яиц17.
Хотя анализ базовых уровней кортизола из плавников и челюстных костей осетровых требует, чтобы рыба была усыплена, этот подход не влечет за собой инвазивных методов, необходимых для взятия проб крови у живого осетра. Образцы фин и челюстной кости легко собираются, и извлечение из этих тканей может быть выполнено быстро. Аналогичным образом, экстракция гормонов и анализ являются простыми и требуют мало специализированного оборудования.
В этом исследовании мы представляем новую и легко применяемую технику для извлечения, мытья и определения кортизола из рыбных плавников и челюстных костей, с целью определения того, могут ли уровни кортизола, измеренные из этих матриц, надежно использоваться в качестве стресса Показатели. Преимущества этого метода включают простой и неинвазивный подход8, меньше вариации данных, и надежный выход1,6,8,17; этот метод применим к видам рыб без чешуи, такой как осетр. Техника требует забоя рыбы, выбора соответствующих растворителей для мытья2,4,правильной шлифовки образцов3,5,профессионального ферментосвязанного иммуносорбента (ELISA) применение5,7, и обширные знания о включении источников кортизола в твердые матрицы6.
Мы применили два различных растворителя стирки (ультрачистая вода и изопропанол) для получения базального кортизола в плавниках от трех видов осетровых: белуги (Huso huso), Сибирский (Acipenser baerii), и sevruga (A. stellatus ), в стандартных условиях окружающей среды для каждого вида. Челюсти H. huso также использовались для оценки стресса у осетровых. Это первое исследование для измерения уровня кортизола в осетровых челюстных костях. Результаты этого исследования позволят предоставить сравнительные данные кортизола для видов осетровых на ранней стадии роста (1 год) до определения пола.
Protocol
Representative Results
Discussion
Осетр иногда называют “живой ископаемого”, потому что он показал несколько адаптаций на протяжении последних тысячелетий. Осетровый род Acipenser содержит 27 видов, которые производят икру; однако, три вида (белуга, баэрии и севруга) производят большую часть мирового предложения икры. Ос…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была проведена при поддержке Программы совместных исследований в области сельского хозяйства науки и развития технологий (название проекта: Анализ изменения продуктивности животноводства с изменением климата, Проект No. PJ012771), Управление развития сельских районов, Республика Корея. Кроме того, это исследование было поддержано грантом (Нет. PJ01344604) от команды по питанию и физиологии животных, Национальный институт наук и животных, RDA, Сеул, Республика Корея. Авторы с благодарностью признают персидского жеста генеральный директор Мохаммад Хасан Салманзаде и его команда, которая предоставила рыбу из трех видов осетровых рассмотрены в этом исследовании.
Materials
| Disposal latex surgical gloves | Ansell | 63754090 |
| Platform scale-electronic weighing 100kg | Baskoolnikoo | 101 EM |
| Serological pipette to deliver up to 24 mL | Becton Dickinson Falcon | 35-7550 |
| Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters | BioTek | 8041000 |
| Reagent reservoirs | BrandTech | 703459 |
| Zipper storage plastic bag | Cleanwrap | 30cm x100m |
| Isopropyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5035-4400 |
| Methyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5558-4100 |
| Tube rotator- MX-RL-Pro | DLAB Scientific | 824-222217777 |
| Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL | Eppendorf Research Plus | M21518D |
| Precision pipette to deliver 15 and 25 μL | Eppendorf Research Plus | R25623C |
| Weighing paper (107 x 210 mm) | Fisherbrand | 09-898-12B |
| Bead beater, 50/60 Hz 2A | GeneReach Biotechnology Corp | tp0088 |
| Plate rotator with orbit capable of 500 rpm | Hangzhou Miu Instrument | MU-E30-1044 |
| Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL | Hyundai Micro | H20050 |
| Fume hood | Kwang Dong Industrial | KD 901-22128175 |
| Micro-centrifuge capable of 1500 x g | Labo Gene | 9.900.900.729 |
| Mini vortex mixer | LMS | VTX-3000L |
| Lotte aluminum foil roll | Lotte Aluminum | B0722X5FK5 |
| Digital scale | Mettler Toledo | ME204 |
| Ultrapure water | MDM | MDM-0110 |
| Pipette tips | Neptune Scientific | REF 2100.N |
| Large fish net | Pond H2O | Hoz135 |
| Salivary cortisol kit | Salimetrics | 1-3002-4 |
| Bone cutting forceps | Sankyo | 26-188A |
| Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL | VITLAB | 18A68756 |
| Towel | Yuhan Kimberly | 1707921546 |
| Tissue paper (107 × 210) | Yuhan Kimberly | 41117 |
References
- Meyer, J. S., Novak, M. A. Hair cortisol: a novel biomarker of hypothalamic-pituitary- adrenocortical activity. Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).
- Ghassemi Nejad, J., et al. A cortisol study: facial hair and nails. Journal of Steroids Hormonal Sciences. 7, 1-5 (2016).
- Meyer, J. S., Novak, M. A., Hamel, A., Rosenberg, K. Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair. Journal of Visualized Experiments. (83), e50882 (2014).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. General and Comparative Endocrinology. 147, 255-261 (2006).
- Ghassemi Nejad, J., Ataallahi, M., Park, H. K. Methodological validation of measuring Hanwoo hair cortisol concentration using bead beater and surgical scissors. Journal of Animal Science and Technology. 61, 41-46 (2019).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Wool cortisol is a better indicator of stress than blood cortisol in ewes exposed to heat stress and water restriction. Animal. 8, 128-132 (2014).
- Brossa, A. C. . Cortisol in skin mucus and scales as a measure of fish stress and habitat quality. Ph.D. dissertation. , (2018).
- Carbajal, A., et al. Cortisol detection in fish scales by enzyme immunoassay: biochemical and methodological validation. Journal of Applied Ichthyology. 34, 1-4 (2018).
- Bertotto, D., et al. Alternative matrices for cortisol measurement in fish. Aquaculture Research. 41, 1261-1267 (2010).
- Ghassemi Nejad, J., Jeong, C., Shahsavarani, H., Sung, I. K., Lee, J. Embedded dental cortisol content: a pilot study. Endocrinology & Metabolic Syndrome. 5, 240 (2016).
- Pankhurst, N. W. The endocrinology of stress in fish: an environmental perspective. General and Comparative Endocrinology. 170, 265-275 (2011).
- Ghassemi Nejad, J., Kim, W. B., Lee, B. H., Sung, K. I. Coat and hair color: hair cortisol and serotonin levels in lactating Holstein cows under heat stress conditions. Animal Science Journal. 88, 190-194 (2017).
- Baker, M. R., Gobush, K. S., Vynne, C. H. Review of factors influencing stress hormones in fish and wildlife. Journal of Nature Conservation. 21, 309-318 (2013).
- Aerts, J., et al. Scales tell a story on the stress history of fish. PLoS One. 10, e0123411 (2015).
- Heimbürge, S., Kanitz, E., Otten, W. The use of hair cortisol for the assessment of stress in animals. General and Comparative Endocrinology. , 10-17 (2019).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Comparing hair cortisol concentrations from various body sites and serum cortisol in Holstein lactating cows and heifers during thermal comfort zone. Journal of Veterinary Behavior: Clinical and Application Research. 30, 92-95 (2019).
- Bussy, U., Wassink, L., Scribner, K. T., Li, W. Determination of cortisol in lake sturgeon (Acipenser fulvescens) eggs by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 1040, 162-168 (2017).
- SAS. 1999. . SAS. User’s Guide (Version 8.01 Edition). , (1999).
- Barton, B. A. Stress in fishes: a diversity of responses with particular reference to changes in circulating corticosteroids. Integrative and Comparative Biology. 42, 517-525 (2002).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Measuring hair and blood cortisol in sheep and dairy cattle using RIA and ELISA assay: a comparison. Biological Rhythm Research. Accepted. , (2019).
