Kortisol extraktion från Sturgeon fin och käkbenet matriser
Summary
I denna studie, vi presenterar ett protokoll för kortisol extraktion från fenan och käkbenet av stör arter. Och käkbenet kortisolnivåer granskades ytterligare genom att jämföra två tvättmedel följt av ELISA-analyser. Denna studie Lopar genomförbarheten av Jawbone kortisol som en roman stress indikator.
Abstract
Syftet med denna studie var att utveckla en teknik för utvinning av kortisol från stör fenor med hjälp av två tvättmedel (vatten och isopropanol) och kvantifiera eventuella skillnader i fenkortisolnivåer bland tre huvud stör arter. Fenor skördades från 19 offrade störer inklusive sju Beluga (och och), sju sibiriska (Acipenser baerii), och fem sevruga (A. stellatus). Den Sturgeons växte upp i iranska gårdar för 2 år (2017-2018), och kortisol extraktion analys genomfördes i Sydkorea (januari-februari 2019). Jawbones från fem H. och användes också för kortisol extraktion. Data analyserades med hjälp av den generella metoden för linjär modell (GLM) i SAS-miljön. Variationskoefficienterna för intra-och Inter-analysen var 14,15 respektive 7,70. Kort, kortisol utvinning teknik inblandade tvätta proverna (300 ± 10 mg) med 3 mL lösningsmedel (ultrapure vatten och isopropanol) två gånger, rotation vid 80 RPM för 2,5 min, lufttorka de tvättade proverna i rumstemperatur (22-28 ° c) för 7 dagar, ytterligare torkning proverna med en pärlvisp på 50 Hz för 32 min och slipning dem till pulver, tillämpa 1,5 mL metanol till det torkade pulvret (75 ± 5 mg), och långsam rotation (40 rpm) för 18 h vid rumstemperatur med kontinuerlig blandning. Efter extraktion centrifugerades proverna (9 500 x g i 10 min) och 1 ml supernatanten överfördes till ett nytt mikrocentrifugrör (1,5 ml), inkuberades vid 38 ° c för att avdunsta metanol och analyserades via enzymkopplad immunosorbent assay (Elisa) . Inga skillnader observerades i fenkortisolnivåer bland arter eller i fenben och käkbenet kortisolnivåer mellan tvättmedel. Resultaten av denna studie visar att stör Jawbone Matrix är en lovande alternativ stress indikator till solida matriser.
Introduction
Kortisol är en tillförlitlig indikator på djurens stress. Kortisol utvinning ger en giltig ram för forskare att övervaka stressnivåer och allmänna mönster i stressfaktorer. Till exempel, tidigare studier har genomfört metodvalidering av hår kortisol mätningar med hjälp av olika metoder i människor1,2, apor3,4, nötkreatur5, får6, och guldfisk7,8. I fiskarter, kortisol mätningar i matriser såsom skalor, hudslem, avföring, och blod9 har visat sig ge information om fisk hälsa. När blodprovstagning är problematiskt eller skalor saknas, alternativa matriser för kortisol extraktion behövs. I fisk kan alternativa matriser inkludera käkbenet, en hård vävnad som liknar den mänskliga tanden10.
Utvecklingen av nya matriser och validerade tekniker för att fastställa fisk stressnivåer är av särskilt intresse för kaviar industrin, där stör kan uppleva långvarig exponering för miljömässiga stressfaktorer11. Kön av stör kan inte bestämmas före 2 års ålder, och stör inte har skalor. Eftersom kortisol gradvis ackumuleras i fasta matriser under tillväxt Stadium2,7,12, långsiktiga kortisol ackumulation data från hårda matriser såsom fenor och käkben kan ge insikt i stress nivåer vid olika tillväxt stadier. I kontrast, kortisol nivåer i blodet ger en ögonblicksbild av stressnivåer vid tidpunkten för döden och kan inte exakt representera stress under långsiktiga uppfödningsförhållanden13,14. Med ökande konkurrens på marknaden för kaviar är nya metoder för att förbättra stress förhållandena för produktion av sundare ägg bland störarter under långtids uppfödning (8-12 år eller längre) ett allt viktigare forskningsområde. På grund av den höga kostnaden för stör, skördade prover är extremt dyra ($ 8000-15000 per mogen fisk beroende på art och tillväxtskede), en begränsande faktor för forskningsprojekt. Utvecklingen av en lämplig teknik för att utvinna kortisol från störfenor och käkben kan dock med fördel tillämpas både på fisk odlingssystem och i vild fisk för att förbättra kvaliteten och skörden av störägg för både konsumtion och Bevarande.
Förutom att ge tillförlitliga resultat6, är valet av en lämplig kortisol utvinning teknik av avgörande betydelse för att säkerställa att andra föreningar som finns i matrisen under provberedning inte blanda ihop produktionen, vilket kan leda till inkonsekvent resultat. Det är lika viktigt att avgöra om fenan och käkbenet kortisolnivåer påverkas av hormonnivåer i det omgivande vattnet. Heimbürge et al.15 föreslog att ett antal faktorer kan påverka kortisolnivåer inklusive ålder, kön, graviditet, säsong, färg12, och kroppen region från vilken kortisol utvinns16. Emellertid, lite information är tillgänglig om effekterna av tvättmedel på kortisol utvinning i fisk kroppen matriser8, och ingen på dessa effekter i stör, med undantag för stör ägg17.
Även om analys av baslinjen kortisolnivåer från fenor och käkben av stör kräver att fisken euthanized, detta tillvägagångssätt innebär inte de invasiva metoder som krävs för blodprovstagning i levande stör. Fin och käkbenet prover är lätt samlas in, och extraktion från dessa vävnader kan utföras snabbt. Likaså, hormon utvinning och analys är enkla och kräver lite specialiserad utrustning.
I denna studie presenterar vi en ny och lätt tillämpad teknik för utvinning, tvättning, och bestämning av kortisol från fisk fenor och käkben, i syfte att avgöra om kortisolnivåer mätt från dessa matriser kan tillförlitligt användas som stress Indikatorer. Fördelarna med denna teknik inkluderar en enkel och icke-invasiv8 tillvägagångssätt, mindre data variation, och tillförlitlig utgång1,6,8,17; tekniken är tillämplig på fiskarter utan fjäll som stör. Tekniken kräver slakt av fisken, val av lämpliga tvättmedel2,4, korrekt slipning av proverna3,5, professionell enzymkopplad immunosorbent assay (Elisa) ansökan5,7, och omfattande kunskap om införlivandet av kortisol källor i fasta matriser6.
Vi tillämpade två olika tvättmedel (ultrarent vatten och isopropanol) för att få basala kortisolnivåer i fenor från tre stör arter : Beluga (och och), sibiriska (Acipenser baerii), och sevruga (A. stellatus ), under standardmiljö förhållanden för varje art. Jawbones av H. och användes också för att utvärdera stress i stör. Detta är den första studien att mäta kortisolnivåer i stör käkben. Resultaten av denna studie kommer att ge jämförande kortisoldata för stör arter i den tidiga tillväxtfasen (~ 1 år) före kön bestämning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sturgeon kallas ibland för “levande fossil” eftersom det har uppvisat få anpassningar under de gångna årtusendena. Den stör släktet Acipenser innehåller 27 arter som producerar kaviar; emellertid, tre arter (Beluga, baerii, och sevruga) producerar de flesta av de globala kaviar utbudet. Stör är sårbara för överfiske och inblandning i deras naturliga livsmiljö och är därför mer akut hotade än någon annan grupp av arter. Sturgeon tillhör den äldsta gruppen av levande ryggradsdjur, som har funni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete genomfördes med stöd av kooperativa forskningsprogrammet för jordbruksvetenskap & teknikutveckling (Projekttitel: boskap produktivitets förändringar analys med klimatförändringar, projekt nr. PJ012771), landsbygdsutvecklings förvaltningen, Republiken Korea. Också, denna studie stöddes av ett bidrag (nej. PJ01344604) från Animal Nutrition & fysiologi team, National Institute of Animal Science, RDA, Seoul, Republiken Korea. Författarna erkänner tacksamt Persiska gest VD Mohammad Hassan Salmanzadeh och hans team, som gav fisk från de tre stör arter som undersökts i denna studie.
Materials
| Disposal latex surgical gloves | Ansell | 63754090 |
| Platform scale-electronic weighing 100kg | Baskoolnikoo | 101 EM |
| Serological pipette to deliver up to 24 mL | Becton Dickinson Falcon | 35-7550 |
| Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters | BioTek | 8041000 |
| Reagent reservoirs | BrandTech | 703459 |
| Zipper storage plastic bag | Cleanwrap | 30cm x100m |
| Isopropyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5035-4400 |
| Methyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5558-4100 |
| Tube rotator- MX-RL-Pro | DLAB Scientific | 824-222217777 |
| Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL | Eppendorf Research Plus | M21518D |
| Precision pipette to deliver 15 and 25 μL | Eppendorf Research Plus | R25623C |
| Weighing paper (107 x 210 mm) | Fisherbrand | 09-898-12B |
| Bead beater, 50/60 Hz 2A | GeneReach Biotechnology Corp | tp0088 |
| Plate rotator with orbit capable of 500 rpm | Hangzhou Miu Instrument | MU-E30-1044 |
| Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL | Hyundai Micro | H20050 |
| Fume hood | Kwang Dong Industrial | KD 901-22128175 |
| Micro-centrifuge capable of 1500 x g | Labo Gene | 9.900.900.729 |
| Mini vortex mixer | LMS | VTX-3000L |
| Lotte aluminum foil roll | Lotte Aluminum | B0722X5FK5 |
| Digital scale | Mettler Toledo | ME204 |
| Ultrapure water | MDM | MDM-0110 |
| Pipette tips | Neptune Scientific | REF 2100.N |
| Large fish net | Pond H2O | Hoz135 |
| Salivary cortisol kit | Salimetrics | 1-3002-4 |
| Bone cutting forceps | Sankyo | 26-188A |
| Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL | VITLAB | 18A68756 |
| Towel | Yuhan Kimberly | 1707921546 |
| Tissue paper (107 × 210) | Yuhan Kimberly | 41117 |
References
- Meyer, J. S., Novak, M. A. Hair cortisol: a novel biomarker of hypothalamic-pituitary- adrenocortical activity. Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).
- Ghassemi Nejad, J., et al. A cortisol study: facial hair and nails. Journal of Steroids Hormonal Sciences. 7, 1-5 (2016).
- Meyer, J. S., Novak, M. A., Hamel, A., Rosenberg, K. Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair. Journal of Visualized Experiments. (83), e50882 (2014).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. General and Comparative Endocrinology. 147, 255-261 (2006).
- Ghassemi Nejad, J., Ataallahi, M., Park, H. K. Methodological validation of measuring Hanwoo hair cortisol concentration using bead beater and surgical scissors. Journal of Animal Science and Technology. 61, 41-46 (2019).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Wool cortisol is a better indicator of stress than blood cortisol in ewes exposed to heat stress and water restriction. Animal. 8, 128-132 (2014).
- Brossa, A. C. . Cortisol in skin mucus and scales as a measure of fish stress and habitat quality. Ph.D. dissertation. , (2018).
- Carbajal, A., et al. Cortisol detection in fish scales by enzyme immunoassay: biochemical and methodological validation. Journal of Applied Ichthyology. 34, 1-4 (2018).
- Bertotto, D., et al. Alternative matrices for cortisol measurement in fish. Aquaculture Research. 41, 1261-1267 (2010).
- Ghassemi Nejad, J., Jeong, C., Shahsavarani, H., Sung, I. K., Lee, J. Embedded dental cortisol content: a pilot study. Endocrinology & Metabolic Syndrome. 5, 240 (2016).
- Pankhurst, N. W. The endocrinology of stress in fish: an environmental perspective. General and Comparative Endocrinology. 170, 265-275 (2011).
- Ghassemi Nejad, J., Kim, W. B., Lee, B. H., Sung, K. I. Coat and hair color: hair cortisol and serotonin levels in lactating Holstein cows under heat stress conditions. Animal Science Journal. 88, 190-194 (2017).
- Baker, M. R., Gobush, K. S., Vynne, C. H. Review of factors influencing stress hormones in fish and wildlife. Journal of Nature Conservation. 21, 309-318 (2013).
- Aerts, J., et al. Scales tell a story on the stress history of fish. PLoS One. 10, e0123411 (2015).
- Heimbürge, S., Kanitz, E., Otten, W. The use of hair cortisol for the assessment of stress in animals. General and Comparative Endocrinology. , 10-17 (2019).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Comparing hair cortisol concentrations from various body sites and serum cortisol in Holstein lactating cows and heifers during thermal comfort zone. Journal of Veterinary Behavior: Clinical and Application Research. 30, 92-95 (2019).
- Bussy, U., Wassink, L., Scribner, K. T., Li, W. Determination of cortisol in lake sturgeon (Acipenser fulvescens) eggs by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 1040, 162-168 (2017).
- SAS. 1999. . SAS. User’s Guide (Version 8.01 Edition). , (1999).
- Barton, B. A. Stress in fishes: a diversity of responses with particular reference to changes in circulating corticosteroids. Integrative and Comparative Biology. 42, 517-525 (2002).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Measuring hair and blood cortisol in sheep and dairy cattle using RIA and ELISA assay: a comparison. Biological Rhythm Research. Accepted. , (2019).
