Introducción de un Knockout Gene Directamente en la etapa de Amastigote de Trypanosoma cruzi usando el sistema CRISPR/Cas9
Summary
Aquí, describimos un protocolo para introducir un knockout genético en el amastigote extracelular de Trypanosoma cruzi, utilizando el sistema CRISPR/Cas9. El fenotipo de crecimiento puede ser seguido ya sea por el recuento celular de la cultura axenic amastigote o por la proliferación de amastigotes intracelulares después de la invasión de la célula huésped.
Abstract
El trypanosoma cruzi es un parásito protozoario patógeno que causa la enfermedad de Chagas principalmente en América Latina. Con el fin de identificar un nuevo objetivo farmacológico contra T. cruzi, es importante validar la esencialidad del gen diana en la etapa de mamíferos del parásito, el amastigote. Amastigotes de T. cruzi se replican dentro de la célula anfitriona; por lo tanto, es difícil llevar a cabo un experimento eliminatorio sin pasar por otras etapas del desarrollo. Recientemente, nuestro grupo informó de una condición de crecimiento en la que el amastigote puede replicar axenéticamente hasta 10 días sin perder sus propiedades similares a amastigote. Mediante el uso de este cultivo axenic amastigote temporal, introdujimos con éxito gRNAs directamente en el amastigote expreso de Cas9 para causar nocauts genéticos y analizar sus fenotipos exclusivamente en la etapa de amastigote. En este informe, describimos un protocolo detallado para producir acomodatigotes extracelulares derivados in vitro, y para utilizar el cultivo axenético en un experimento de nocaut mediado por CRISPR/Cas9. El fenotipo de crecimiento de los amastigotes knockout puede ser evaluado ya sea por recuento saldeo celular del cultivo axenico, o por la replicación del amastigote intracelular después de la invasión de la célula huésped. Este método evita la diferenciación de la etapa del parásito normalmente implicada en la producción de un atigote transgénico o de nocaut. La utilización de la cultura axenic amastigote temporal tiene el potencial de ampliar la libertad experimental de estudios específicos de etapa en T. cruzi.
Introduction
El trypanosoma cruzi es el agente causante de la enfermedad de Chagas, que es frecuente principalmente en América Latina1. T. cruzi tiene etapas distintivas del ciclo de vida,ya que viaja entre un vector de insectos y un huésped de mamíferos 2. T. cruzi se replica como un epimastigote en el intestino medio de un insecto triatomina chupa sangre y se diferencia en un trippomastigono metacíclico infeccioso en su intestino posterior antes de ser depositado en un huésped humano o animal. Una vez que el trippomastigoto entra en el cuerpo del huésped a través del sitio de la picadura o a través de una membrana mucosa, el parásito invade una célula huésped y se transforma en una forma redonda sin flagelado llamada acomodatigote. El amastigote se replica dentro de la célula huésped y finalmente se diferencia en trippomastigote, que sale de la célula huésped y entra en el torrente sanguíneo para infectar a otra célula huésped.
Dado que actualmente se dispone de agentes quimioterápicos, benznazol y nifurtimox, causan efectos secundarios adversos y son ineficaces en la fase crónica de la enfermedad3,es de gran interés identificar nuevos objetivos farmacológicos contra T. cruzi. En los últimos años, el sistema CRISPR/Cas9 se ha convertido en una poderosa herramienta para realizar eficazmente el knockout genético en T. cruzi,ya sea transfectando plásmidos separados o individuales que contengan gRNA y Cas9 4, mediante la expresión estable de Cas9 y posteriores introducción de gRNA5,6,7 o plantilla de transcripción de gRNA8, o por electroporación del complejo preformado gRNA/Cas9 RNP7,9. Se prevé que este avance tecnológico acelere la investigación del objetivo de fármacos en la enfermedad de Chagas.
Para proceder con el desarrollo del fármaco, es crucial validar la esencialidad del gen objetivo o la eficacia de los compuestos candidatos a fármacos en el amastigote de T. cruzi,ya que es la etapa de replicación del parásito en el huésped de mamíferos. Sin embargo, esta es una tarea difícil, porque los amastigotes no se pueden manipular directamente debido a la presencia de una célula huésped obstructiva. En Leishmania, un parásito protozoario estrechamente relacionado con T. cruzi, se desarrolló un método de cultivo axenic amastigote y se ha utilizado en ensayos de detección de drogas10,11,12, 13. Aunque hay algunas discrepancias en la susceptibilidad a los compuestos entre axenic amastigotes y amastigotes intracelulares14, la capacidad de mantener la cultura axenica, sin embargo, proporciona valiosas herramientas experimentales para estudiar el biología básica de la etapa clínicamente relevante de Leishmania15,16. En el caso de T. cruzi, las literaturas sobre la presencia de aamastítas extracelulares (EA)17 de origen natural y la producción in vitro de EA17,18,19 se remontan a hace décadas. Además, EA es conocido por tener una capacidad infecciosa20, aunque menor que la de trypomastigote, y el mecanismo de invasión de host amastigote se ha aclarado en los últimos años (revisado por Bonfim-Melo et al.21). Sin embargo, a diferencia de Leishmania, EA no había sido utilizado como una herramienta experimental en T. cruzi, principalmente porque EA había sido considerado como un parásito intracelular obligado, y por lo tanto no había sido considerado como “forma replicativa” en una práctica Sentido.
Recientemente, nuestro grupo propuso utilizar EA de T. cruzi como una cultura axenica temporal22. Los acomodatos de la cepa T. cruzi Tulahuen pueden replicarse libres de células huésped en medio LIT a 37 oC durante un máximo de 10 días sin deterioro importante o pérdida de propiedades similares a amastigote. Durante el período de crecimiento sin anfitrión, EA fue utilizado con éxito para la expresión génica exógena por electroporación convencional, ensayo de valoración de fármacos con compuestos trippanocidas, y eliminación mediada por CRISPR/Cas9 seguido de monitoreo de fenotipo de crecimiento. En este informe, describimos el protocolo detallado para producir EA derivado in vitro y para utilizar el axenic amastigote en experimentos eliminatorios.
Protocol
Representative Results
Discussion
Demostramos que el cultivo axenico de Los amastigotes de T. cruzi se puede utilizar en el knockout de genes mediado por CRISPR/Cas9, electroportando el ARNM en forma directa en el EA que expresa Cas9. De esta manera, la esencialidad del gen objetivo específicamente en la etapa de amastigote puede ser evaluada sin pasar por otras etapas del desarrollo.
Otro aspecto beneficioso de la transfección de amastigote es la conveniencia en las pruebas para un gran número de genes diana. Una …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por JSPS KAKENHI Grant Number 18K15141 a Y.T.
Materials
| 20% formalin solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 068-03863 | fixing cells |
| 25 cm2 double seal cap culture flask | AGC Techno Glass | 3100-025 | |
| 75 cm2 double seal cap culture flask | AGC Techno Glass | 3110-075 | |
| All-in One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X710 | |
| Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for Control) | IDT | custom made | target sequence = GGACGGCACCTTCATCTACAAGG |
| Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for TcCGM1) | IDT | custom made | target sequence = TAGCCGCGATGGAGAGTTTATGG |
| Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for TcPAR1) | IDT | custom made | target sequence = CGTGGAGAACGCCATTGCCACGG |
| Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA | IDT | 1072532 | to anneal with crRNA |
| Amaxa Nucleofector device | LONZA | AAN-1001 | electroporation |
| Basic Parasite Nucleofector Kit 2 | LONZA | VMI-1021 | electroporation |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | component of the medium for in-vitro amastigogenesis |
| Burker-Turk disposable hemocytometer | Watson | 177-212C | cell counting |
| Coster 12-well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3513 | |
| DMEM | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 044-29765 | culture medium |
| Fetal bovine serum, Defined | Hyclone | SH30070.03 | heat-inactivate before use |
| G-418 Sulfate Solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 077-06433 | selection of transformant |
| Hemin chloride | Sigma-Aldrich | H-5533 | component of LIT medium |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | staining of nuclei |
| Liver infusion broth, Difco | Becton Dickinson | 226920 | component of LIT medium |
| MES | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 349-01623 | component of the medium for in-vitro amastigogenesis |
| PBS (–) | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 166-23555 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | staining of dead cells |
| RPMI 1646 | Sigma-Aldrich | R8758 | medium for metacyclogenesis |
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