أداء العضلات الهيكلية البشرية Xenografts في الفئران نقص المناعة
Summary
ويمكن أن تكون الأمراض البشرية المعقدة صعبة في نموذج النظم النموذجية المختبرية التقليدية. هنا، ونحن نصف النهج الجراحي لنموذج مرض العضلات البشرية من خلال زرع الخزعات العضلات الهيكلية البشرية في الفئران نقص المناعة.
Abstract
آثار العلاج التي لوحظت في الدراسات الحيوانية غالبا ما تفشل في تلخيصها في التجارب السريرية. وفي حين أن هذه المشكلة متعددة الأوجه، فإن أحد أسباب هذا الفشل هو استخدام نماذج مختبرية غير كافية. ومن الصعب وضع نموذج للأمراض البشرية المعقدة في الكائنات المختبرية التقليدية، ولكن يمكن التحايل على هذه المسألة من خلال دراسة xenografts البشرية. الطريقة الجراحية التي نصفها هنا يسمح لخلق العضلات والهيكل العظمي البشري xenografts، والتي يمكن استخدامها لنموذج مرض العضلات وإجراء الاختبارات العلاجية قبل السريرية. بموجب بروتوكول وافق عليه مجلس المراجعة المؤسسية (IRB)، يتم الحصول على عينات العضلات الهيكلية من المرضى ومن ثم زرعها في NOD-Rag1فارغةIL2rγnull (NRG) الفئران المضيفة. هذه الفئران هي المضيفين المثاليين لدراسات زرع بسبب عدم قدرتها على جعل الخلايا الليمفاوية ناضجة وبالتالي غير قادرة على تطوير الخلايا بوساطة والفكاهة الاستجابات المناعية التكيفية. يتم التخدير الفئران المضيفة مع isoflurane، وإزالة العضلات الطويلة الرقمي الفأر الأمامي والموسعة. ثم يتم وضع قطعة من العضلات البشرية في المقصورة الفارغة الساقية وخياطة إلى الأوتار القريبة والبعيدة من العضلات الطويلة البريونة. يتم الأوعية الدموية بشكل عفوي العضلات xenografted وinnervated من قبل المضيف الماوس, مما أدى إلى العضلات البشرية تجدد بقوة التي يمكن أن تكون بمثابة نموذج للدراسات ما قبل السريرية.
Introduction
وقد أفيد أن 13.8٪ فقط من جميع برامج تطوير الأدوية التي تخضع لتجارب سريرية ناجحة وتؤدي إلى العلاجات المعتمدة1. في حين أن معدل النجاح هذا أعلى من 10.4٪ التي تم الإبلاغ عنها سابقا2، لا يزال هناك مجال كبير للتحسين. أحد النهج لزيادة معدل نجاح التجارب السريرية هو تحسين النماذج المختبرية المستخدمة في البحوث ما قبل السريرية. تتطلب إدارة الغذاء والدواء (FDA) دراسات حيوانية لإظهار فعالية العلاج وتقييم السمية قبل المرحلة 1 من التجارب السريرية. ومع ذلك، غالبا ما يكون هناك توافق محدود في نتائج العلاج بين الدراسات الحيوانية والتجارب السريرية3. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الحاجة إلى دراسات حيوانية قبل السريرية يمكن أن تكون حاجزا لا يمكن التغلب عليه للتنمية العلاجية في الأمراض التي تفتقر إلى نموذج حيواني مقبول، وهو ما يحدث في كثير من الأحيان بالنسبة للأمراض النادرة أو المتفرقة.
إحدى الطرق لنمذجة المرض البشري هي عن طريق زرع الأنسجة البشرية في الفئران التي تعاني من نقص المناعة لتوليد xenografts. هناك ثلاث مزايا رئيسية لنماذج xenograft: أولا، أنها يمكن أن تلخص التشوهات الوراثية والجينية المعقدة الموجودة في الأمراض البشرية التي قد لا تكون قابلة للاستنساخ في نماذج حيوانية أخرى. ثانياً، يمكن استخدام الجرافوجرافات لنمذجة الأمراض النادرة أو المتفرقة إذا كانت عينات المرضى متوفرة. ثالثا، xenografts نموذج المرض داخل نظام كامل في الجسم الحي. لهذه الأسباب، ونحن نفترض أن نتائج فعالية العلاج في نماذج xenograft هي أكثر عرضة للترجمة إلى التجارب في المرضى. وقد استخدمت بالفعل xenografts الورم البشري بنجاح لتطوير علاجات للسرطانات الشائعة، بما في ذلك الورم النقوي المتعدد، فضلا عن العلاجات الشخصية للمرضى الفردية4،5،6، 7.
في الآونة الأخيرة، وقد استخدمت xenografts لتطوير نموذج من أمراض العضلات البشرية8. في هذا النموذج، يتم زرع عينات خزعة العضلات البشرية في الأطراف الخلفية من الفئران NRG نقص المناعة لتشكيل xenografts. يموت الميوفيبر البشري المزروع، ولكن الخلايا الجذعية للعضلات البشرية الموجودة في xenograft في وقت لاحق توسيع وتمييز إلى myofibers الإنسان الجديد الذي يعيد ملء لامينا القاعدية البشرية engrafted. ولذلك، فإن myofibers مجددة في هذه xenografts هي الإنسان تماما ويتم تلقائيا إعادة الأوعية الدموية وinnervated من قبل المضيف الماوس. الأهم من ذلك، ضمور العضلات اللفافة (FSHD) أنسجة العضلات المريض زرعها في الفئران يلخص السمات الرئيسية للمرض البشري، وهي التعبير عن عامل النسخ DUX4 8. ويتسبب FSHD من الإفراط في التعبير عن DUX4، الذي يتم إسكاته جينيا في أنسجة العضلات الطبيعية9،10. في نموذج xenograft FSHD, وقد ثبت العلاج مع morpholino DUX4 محددة لقمع بنجاح التعبير DUX4 وظيفة, وقد يكون خيارا علاجيا محتملا للمرضى FSHD11. وتبين هذه النتائج أن xenografts العضلات البشرية هي نهج جديد لنموذج مرض العضلات البشرية واختبار العلاجات المحتملة في الفئران. هنا، ونحن نصف بالتفصيل الطريقة الجراحية لخلق العضلات والهيكل العظمي البشري xenografts في الفئران نقص المناعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
xenografts المستمدة من المريض هي وسيلة مبتكرة لنموذج مرض العضلات وإجراء دراسات ما قبل السريرية. الطريقة الموضحة هنا لإنشاء xenografts العضلات الهيكلية سريعة ومباشرة، واستنساخ. يمكن إجراء العمليات الجراحية من جانب واحد في 15 إلى 25 دقيقة، أو ثنائيا في 30 إلى 40 دقيقة. يمكن أن توفر xenografts الثنائية مرونة ت?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد حظيت هذه الأعمال بدعم من رابطة استئصال الميوست ومؤسسة بيتر باك. نود أن نشكر الدكتورة يوانفان تشانغ على مشاركتها خبرتها وتدريبها في تقنية xenograft الجراحية.
Materials
| 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 20 x 30 mm micro cover glass | VWR | 48393-151 | |
| Animal Weighing Scale | Kent Scientific | SCL- 1015 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning, Cellgro | 30-004-CI | |
| AutoClip System | F.S.T | 12020-00 | |
| Castroviejo Needle Holder | F.S.T | 12565-14 | |
| Chick embryo extract | Accurate | CE650TL | |
| CM1860 UV cryostat | Leica Biosystems | CM1860UV | |
| Coplin staining jar | Thermo Scientific | 19-4 | |
| Dissection Pins | Fisher Scientific | S13976 | |
| Dry Ice – pellet | Fisher Scientific | NC9584462 | |
| Embryonic Myosin antibody | DSHB | F1.652 | recommended concentration 1:10 |
| Ethanol | Fisher Scientific | 459836 | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Fiber-Lite MI-150 | Dolan-Jenner | Mi-150 | |
| Forceps | F.S.T | 11295-20 | |
| Goat anti-mouse IgG1, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21121 | recommended concentration 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG2b, AlexaFluor 594 | Invitrogen | A-21145 | recommended concentration 1:500 |
| Gum tragacanth | Sigma | G1128 | |
| Hams F-10 Medium | Corning | 10-070-CV | |
| Histoacryl Blue Topical Skin Adhesive | Tissue seal | TS1050044FP | |
| Human specific lamin A/C antibody | Abcam | ab40567 | recommended concentration 1:50-1:100 |
| Human specific spectrin antibody | Leica Biosystems | NCLSPEC1 | recommended concentration 1:20-1:100 |
| Induction Chamber | VetEquip | 941444 | |
| Iris Forceps | F.S.T | 11066-07 | |
| Irradiated Global 2018 (Uniprim 4100 ppm) | Envigo | TD.06596 | Antibiotic rodent diet to protect again respiratory infections |
| Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | surgical wipes |
| Mapleson E Breathing Circuit | VetEquip | 921412 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Mobile Anesthesia Machine | VetEquip | 901805 | |
| Mouse on Mouse Basic Kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | mouse IgG blocking reagent |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| NAIR Hair remover lotion/oil | Fisher Scientific | NC0132811 | |
| NOD-Rag1null IL2rg null (NRG) mice | The Jackson Laboratory | 007799 | 2 to 3 months old |
| O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| PBS (phosphate buffered saline) buffer | Fisher Scientific | 4870500 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P10144 (no DAPI); P36935 (with DAPI) | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | |
| Rimadyl (carprofen) injectable | Patterson Veterinary | 10000319 | surgical analgesic, administered subcutaneously at a dose of 5mg/kg |
| Scalpel Blades – #11 | F.S.T | 10011-00 | |
| Scalpel Handle – #3 | F.S.T | 10003-12 | |
| Stereo Microscope | Accu-scope | 3075 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Suture, Synthetic, Non-Absorbable, 30 inches long, CV-11 needle | Covidien | VP-706-X | |
| 1ml Syringe (26 gauge, 3/8 inch needle) | BD Biosciences | 329412 | |
| Trimmer | Kent Scientific | CL9990-KIT | |
| Vannas Spring Scissors, 8.0 mm cutting edge | F.S.T | 15009-08 | |
| VaporGaurd Activated Charcoal Filter | VetEquip | 931401 | |
| Wound clips, 9 mm | F.S.T | 12022-09 |
References
- Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. , 1-14 (2018).
- Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nature Biotechnology. 32, 40-51 (2014).
- Perel, P., et al. Comparison of treatment effects between animal experiments and clinical trials: systematic review. BMJ. 334, 1-6 (2007).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology Therapeutics. 85, 217-221 (2009).
- Roberts, K. G., et al. Targetable Kinase-Activating Lesions in Ph-like Acute Lymphoblastic Leukemia. New England Journal of Medicine. 371, 1005-1015 (2014).
- Kim, J., et al. GDF11 Controls the Timing of Progenitor Cell Competence in Developing Retina. Science. 308, 1927-1930 (2005).
- Sako, D., et al. Characterization of the ligand binding functionality of the extracellular domain of activin receptor type IIB. Journal of Biological Chemisty. 285, 21037-21048 (2010).
- Zhang, Y., et al. Human skeletal muscle xenograft as a new preclinical model for muscle disorders. Human Molecular Genetics. 23, 3180-3188 (2014).
- Gabellini, D., Green, M. R., Tupler, R. Inappropriate Gene Activation in FSHD : A Repressor Complex Binds a Chromosomal Repeat Deleted in Dystrophic Muscle. Cell. 110, 339-348 (2002).
- Lemmers, R. J. L. F., et al. A Unifying Genetic Model for Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy. Science. 329, 1650-1654 (2010).
- Chen, J. C. J., et al. Morpholino-mediated Knockdown of DUX4 Toward Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy Therapeutics. Molecular Therapy. 24, 1405-1411 (2016).
- Medical Research Council. . Aids to the investigation of the peripheral nervous system. , (1943).
- Jones, R. A., et al. Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction. Cell Reports. 21, 2348-2356 (2017).
