Summary

Isolation, Transfektion und Kultur der primären menschlichen Monozyten

Published: December 16, 2019
doi:

Summary

Hier wird ein optimiertes Protokoll zur Isolierung, Kultivierung, Transfekung und Unterscheidung menschlicher Primärmonozyten von HIV-infizierten Personen und gesunden Kontrollen vorgestellt.

Abstract

Trotz der Einführung einer kombinierten antiretroviralen Therapie (cART) Mitte der 1990er Jahre ist das Humanimmundefizienzvirus (HIV) nach wie vor ein großes Gesundheitsproblem. Während die antiretrovirale Therapie die systemische Viruslast effizient senkt und die normale CD4+ T-Zellzahl wiederherstellt, stellt sie kein vollständig funktionierendes Immunsystem wieder her. Ein dysfunktionales Immunsystem bei HIV-infizierten Personen, die sich cART unterziehen, kann durch Immunaktivierung, frühe Alterung von Immunzellen oder anhaltende Entzündungen gekennzeichnet sein. Diese Bedingungen, zusammen mit komorbiden Faktoren im Zusammenhang mit HIV-Infektion, erhöhen die Komplexität der Krankheit, die nicht leicht in Zell- und Tiermodellen reproduziert werden kann. Um die molekularen Ereignisse zu untersuchen, die der Immunfunktionsstörung bei diesen Patienten zugrunde liegen, wird hier ein System zur Kultur und Manipulation menschlicher Primärmonozyten in vitro vorgestellt. Insbesondere ermöglicht das Protokoll die Kultur und Transfektion von primären CD14+ Monozyten, die von HIV-infizierten Personen, die sich cART unterziehen, sowie von HIV-negativen Kontrollen erhalten werden. Die Methode umfasst Isolation, Kultur und Transfektion von Monozyten und monozytenabgeleiteten Makrophagen. Während handelsübliche Kits und Reagenzien eingesetzt werden, bietet das Protokoll wichtige Tipps und optimierte Bedingungen für die erfolgreiche Haftung und Transfektion von Monozyten mit miRNA-Mimik und Inhibitoren sowie mit siRNAs.

Introduction

Eine Infektion mit dem Humanimmundefizienzvirus-1 (HIV-1) verursacht eine schwere Immunfunktionsstörung, die zu opportunistischen Infektionen und erworbenen Immunschwächesyndromen (AIDS) führen kann. Obwohl HIV-infizierte Patienten, die sich cART unterziehen, durch geringe Viruslasten und normale CD4+ T-Zellzahlen gekennzeichnet sind, kann die Funktion des Immunsystems bei diesen Personen beeinträchtigt werden, was zu einer dysfunktionalen Immunantwort führt, die mit einem erhöhten Risiko für die Entwicklung von Krebs verbunden ist1. Die Mechanismen der Immunfunktionsstörung bei HIV-Patienten auf cART bleiben weitgehend unbekannt. Daher ist die Charakterisierung von immunbasierten Immunzellen durch Patienten und die Untersuchung ihrer Biologie und Funktion ein kritischer Bestandteil der aktuellen HIV-Forschung.

Monozyten und Makrophagen sind wichtige Regulatoren von Immunantworten und spielen eine grundlegende Rolle bei der HIV-Infektion2,3,4,5. Heterogen und plastisch können Makrophagen grob in klassisch aktiviert (M1) oder alternativ aktiviert (M2) klassifiziert werden. Während diese allgemeine Klassifizierung bei der Einrichtung experimenteller Bedingungen notwendig ist, kann der Polarisationsstatus von Makrophagen durch eine Vielzahl von Zytokinen6,7,8,9umgekehrt werden. Obwohl mehrere Studien die Auswirkungen einer HIV-Infektion auf Monozyten und dendritische Zellen untersucht haben, sind molekulare Details von monozytenvermittelten Reaktionen weitgehend unbekannt6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Unter den Faktoren, die an der Immunzellregulation und -funktion beteiligt sind, haben sich gezeigt, dass microRNAs (miRNAs), kurze nicht-kodierende RNAs, die die Genexpression posttranscriptativ regulieren, eine wichtige Rolle im Kontext wichtiger zellulärer Pfade spielen (d. h. Wachstum, Differenzierung, Entwicklung und Apoptose)20. Diese Moleküle wurden als wichtige Regulatoren von Transkriptionsfaktoren beschrieben, die für die Diktat der funktionellen Polarisation von Makrophagen21unerlässlich sind. Die potenzielle Rolle von miRNAs bei Monozyten von HIV-infizierten Personen, die sich cART unterziehen, wurde untersucht, aber Fortschritte auf diesem Gebiet erfordern viel mehr Arbeit22,23,24,25,26. In diesem Beitrag wird eine optimierte Methode zur Transfektion von miRNAs und siRNAs in primäre menschliche Monozyten von HIV-infizierten Patienten und Kontrollen behandelt.

Dieses Protokoll stützt sich auf handelsübliche Reagenzien und Kits, da die Kontinuität des technischen Verfahrens dazu beiträgt, unnötige experimentelle Variablen bei der Arbeit mit klinischen Proben zu vermeiden. Nichtsdestotrotz gibt die Methode wichtige Tipps (d.h. die Anzahl der zellenbeschichteten oder kurzen Inkubation mit serumfreien Medien, um die Haftung der Zellen an der Platte zu fördern). Zusätzlich werden die in diesem Protokoll verwendeten Polarisationsbedingungen aus veröffentlichten Arbeitenabgeleitet 27,28,29.

Protocol

Alle unten beschriebenen Methoden wurden vom Louisiana State University Health Sciences Center New Orleans Institutional Review Board genehmigt. Das gesamte Blut wurde nach Einholung der Einwilligung in Kenntnis der Sachlage entnommen. HINWEIS: Das gesamte Verfahren wird unter sterilen Bedingungen in einer Biosicherheitseinrichtung der Stufe 2 (BSL2) durchgeführt, so dass beim Umgang mit biologischen Materialien Vorsicht geboten ist. Insbesondere wird jeder Schritt mit sterilen Techniken unte…

Representative Results

Mit dem beschriebenen Verfahren wurden primäre menschliche Monozyten von HIV-infizierten Personen und gesunden Spendern isoliert. Alle hier vorgestellten Daten stammen von HIV+ Probanden, die sich mit niedrigen (<20 Kopien/ml) oder nicht nachweisbaren Viruslasten und normalen CD4+ T-Zellzahlen unter cART befinden. Unmittelbar nach der Isolierung wurden Zellen befleckt und die Durchflusszytometrie durchgeführt, um die Reinheit der Zellpopulationen zu bestätigen. Di…

Discussion

Das vorgestellte Protokoll zeigt die Verwendung von Primärzellen von HIV-infizierten Probanden als Modell für die Untersuchung von Monozyten und Makrophagen. HIV+ Patienten, die sich mit cART unterziehen, leben mehrere Jahre mit einer Infektion und können auch andere Co-Infektionen haben, die mit einem geschwächten Immunsystem zusammenhängen. Um die Immunmodulation in Gegenwart einer chronischen HIV-Infektion zu untersuchen, wurden Zellen direkt von Patienten geerntet. Da sich gezeigt hat, dass miRNAs ein…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken dem HIV Clinical/Tumor Biorepository Core für die Bereitstellung von Patientenproben und dem Cellular Immunology Metabolism Core für die Bereitstellung von Durchflusszytometrieanalysen. Dieses Projekt wurde von NIH P20GM121288 und P30GM114732 finanziert.

Materials

0.5M EDTA Invitrogen AM9260G
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA BD Biosciences 366643
Brilliant Stain Buffer BD Horizon 563794 Flow cytometry
CD14 PerCP Invitrogen 46-0149-42 Flow cytometry- conjugated antibody
CD163 BV711 BD Horizon 563889 Flow cytometry- conjugated antibody
CD209 BV421 BD Horizon 564127 Flow cytometry- conjugated antibody
CD80 FITC BD Horizon 557226 Flow cytometry- conjugated antibody
CD83 APC BD Horizon 551073 Flow cytometry- conjugated antibody
Easy 50 EasySep Magnet StemCell Technologies 18002
Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit StemCell Technologies 19669
EIF4EBP1 mAb Cell Signaling 9644 Monoclonal antibody for Western blot
EIF4EBP1 siRNA Santa Cruz sc-29594
Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated Hyclone SH30070.03HI
Gallios Flow Cytometer Beckman Coulter B43618
GAPDH mAb Santa Cruz SC-47724 Monoclonal antibody for Western blot
HuFcR Binding Inhibitor eBiosciences 14-9161-73 Flow cytometry- blocking buffer
Kaluza Analysis Software Beckman Coulter B16406 Software to analyze flow cytometry data
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5 Sigma L4524
miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p Qiagen YM00472124
MISSION miRNA Negative Control Sigma HMC0002 Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye
Nunc 35mm Cell Culture Dish Thermo Scientific 150318
PBS Gibco 20012027
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Recombinant Human GM-CSF R&D Systems 215-GM-050
Recombinant Human IFN-γ R&D Systems 285-IF-100
Recombinant Human IL-4 R&D Systems 204-IL-010
Recombinant Human M-CSF R&D Systems 216-MC-025
RPMI 1640 with L-Glutamine Corning 10040CVMP
Scrambled Control siRNA Santa Cruz sc-37007
Viromer Blue Transfection Reagent Kit Lipocalyx VB-01LB-01
WST-1 Cell Proliferation Reagent Roche 5015944001 Colorimetric assay to assess cell viability

References

  1. Slim, J., Saling, C. F. A Review of Management of Inflammation in the HIV Population. Biomedical Research International. 2016, 3420638 (2016).
  2. Herskovitz, J., Gendelman, H. E. HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug Delivery to Viral Eradication. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 52-67 (2019).
  3. Machado Andrade, V., Stevenson, M. Host and Viral Factors Influencing Interplay between the Macrophage and HIV-1. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 33-43 (2019).
  4. Merino, K. M., Allers, C., Didier, E. S., Kuroda, M. J. Role of Monocyte/Macrophages during HIV/SIV Infection in Adult and Pediatric Acquired Immune Deficiency Syndrome. Frontiers in Immunology. 8, 1693 (2017).
  5. Wacleche, V. S., Tremblay, C. L., Routy, J. P., Ancuta, P. The Biology of Monocytes and Dendritic Cells: Contribution to HIV Pathogenesis. Viruses. 10 (2), (2018).
  6. Davis, M. J., et al. Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection. MBio. 4 (3), e00264 (2013).
  7. Raggi, F., et al. Regulation of Human Macrophage M1-M2 Polarization Balance by Hypoxia and the Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 1097 (2017).
  8. Van Overmeire, E., et al. M-CSF and GM-CSF Receptor Signaling Differentially Regulate Monocyte Maturation and Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment. 암 연구학. 76 (1), 35-42 (2016).
  9. Vogel, D. Y., et al. Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared. Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).
  10. Almeida, M., Cordero, M., Almeida, J., Orfao, A. Different subsets of peripheral blood dendritic cells show distinct phenotypic and functional abnormalities in HIV-1 infection. AIDS. 19 (3), 261-271 (2005).
  11. Ciesek, S., et al. Impaired TRAIL-dependent cytotoxicity of CD1c-positive dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection. Journal of Viral Hepatitis. 15 (3), 200-211 (2008).
  12. Granelli-Piperno, A., Golebiowska, A., Trumpfheller, C., Siegal, F. P., Steinman, R. M. HIV-1-infected monocyte-derived dendritic cells do not undergo maturation but can elicit IL-10 production and T cell regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7669-7674 (2004).
  13. Hearps, A. C., et al. HIV infection induces age-related changes to monocytes and innate immune activation in young men that persist despite combination antiretroviral therapy. AIDS. 26 (7), 843-853 (2012).
  14. Heggelund, L., et al. Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences. Clinical and Experimental Immunology. 138 (1), 116-121 (2004).
  15. Hernandez, J. C., et al. Up-regulation of TLR2 and TLR4 in dendritic cells in response to HIV type 1 and coinfection with opportunistic pathogens. AIDS Research and Human Retroviruses. 27 (10), 1099-1109 (2011).
  16. Hernandez, J. C., Latz, E., Urcuqui-Inchima, S. HIV-1 induces the first signal to activate the NLRP3 inflammasome in monocyte-derived macrophages. Intervirology. 57 (1), 36-42 (2014).
  17. Low, H. Z., et al. TLR8 regulation of LILRA3 in monocytes is abrogated in human immunodeficiency virus infection and correlates to CD4 counts and virus loads. Retrovirology. 13, 15 (2016).
  18. Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Functional Impairment of Myeloid Dendritic Cells during Advanced Stage of HIV-1 Infection: Role of Factors Regulating Cytokine Signaling. PLoS ONE. 10 (10), e0140852 (2015).
  19. Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Increased expression of negative regulators of cytokine signaling during chronic HIV disease cause functionally exhausted state of dendritic cells. Cytokine. 91, 118-123 (2017).
  20. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  21. Li, H., Jiang, T., Li, M. Q., Zheng, X. L., Zhao, G. J. Transcriptional Regulation of Macrophages Polarization by MicroRNAs. Frontiers in Immunology. 9, 1175 (2018).
  22. Hu, X., et al. Genome-Wide Analyses of MicroRNA Profiling in Interleukin-27 Treated Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Using Deep Sequencing: A Pilot Study. International Journal of Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
  23. Huang, J., et al. MicroRNA miR-126-5p Enhances the Inflammatory Responses of Monocytes to Lipopolysaccharide Stimulation by Suppressing Cylindromatosis in Chronic HIV-1 Infection. Journal of Virology. 91 (10), (2017).
  24. Lodge, R., et al. Host MicroRNAs-221 and -222 Inhibit HIV-1 Entry in Macrophages by Targeting the CD4 Viral Receptor. Cell Reports. 21 (1), 141-153 (2017).
  25. Ma, L., Shen, C. J., Cohen, E. A., Xiong, S. D., Wang, J. H. miRNA-1236 inhibits HIV-1 infection of monocytes by repressing translation of cellular factor VprBP. PLoS ONE. 9 (6), e99535 (2014).
  26. Riess, M., et al. Interferons Induce Expression of SAMHD1 in Monocytes through Down-regulation of miR-181a and miR-30a. Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 264-277 (2017).
  27. Buchacher, T., Ohradanova-Repic, A., Stockinger, H., Fischer, M. B., Weber, V. M2 Polarization of Human Macrophages Favors Survival of the Intracellular Pathogen Chlamydia pneumoniae. PLoS ONE. 10 (11), e0143593 (2015).
  28. Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin. Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).
  29. Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models. Journal of Immunology. 188 (11), 5752-5765 (2012).
  30. Tarique, A. A., et al. Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).

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Cite This Article
Plaisance-Bonstaff, K., Faia, C., Wyczechowska, D., Jeansonne, D., Vittori, C., Peruzzi, F. Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes. J. Vis. Exp. (154), e59967, doi:10.3791/59967 (2019).

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