Summary

原発性ヒト単球の単離、トランスフェクション、培養

Published: December 16, 2019
doi:

Summary

ここでは、HIVに感染した個体および健全なコントロールからヒト一次単球を分離、培養、トランスフェクション、および区別するための最適化されたプロトコルです。

Abstract

ヒト免疫不全ウイルス(HIV)は、1990年代半ばに併用抗レトロウイルス療法(cART)が導入されたにもかかわらず、依然として大きな健康上の懸念事項である。抗レトロウイルス療法は、効率的に全身性ウイルス負荷を低下させ、正常なCD4+T細胞数を復元するが、それは完全に機能的な免疫系を再構成しない。cARTを受けているHIV感染者の機能不全免疫系は、免疫活性化、免疫細胞の早期老化、または持続的な炎症によって特徴付けられる。これらの状態は、HIV感染に関連する併発因子と共に、細胞および動物モデルでは容易に再現できない疾患に複雑さを加える。これらの患者における免疫機能障害の根底にある分子事象を調べるために、インビトロでヒト一次単球を培養および操作するシステムをここに提示する。具体的には、このプロトコルは、cARTを受けているHIV感染個体から得られる一次CD14+単球の培養およびトランスフェクション、ならびにHIV陰性対照から可能である。この方法は、単球および単球由来マクロファージの単離、培養、およびトランスフェクションを含む。市販のキットと試薬が採用されている間、このプロトコルは、miRNA模倣および阻害剤およびsiRNAを用いた単球の付着およびトランスフェクションを成功させるための重要なヒントと最適化された条件を提供する。

Introduction

ヒト免疫不全ウイルス-1(HIV-1)感染は重度の免疫機能障害を引き起こし、日和見感染や後天性免疫不全症候群(AIDS)を引き起こす可能性がある。cARTを受けているHIV感染患者は、ウイルス負荷が低く、正常なCD4+T細胞数を特徴とするが、免疫系の機能はこれらの個体において損なわれ得るが、癌発症するリスクの増加に関連する機能不全免疫応答につながる。cART上のHIV患者における免疫機能障害のメカニズムはほとんど未知のままである。したがって、患者由来の免疫細胞を特徴付け、その生物学と機能を調べるのは、現在のHIV研究の重要な要素です。

単球およびマクロファージは免疫応答の主要な調節剤であり、HIV感染において基本的な役割を果たす2,3,4,5.本質的に異種およびプラスチックは、マクロファージを広く古典的に活性化(M1)または代替活性化(M2)に分類することができる。この一般的な分類は実験条件を設定する際に必要であるが、マクロファージの偏光状態は、種々のサイトカイン6、7、8、9によって逆転してもよい。いくつかの研究は、単球および樹状細胞に対するHIV感染の影響を調査しているが、単球媒介応答の分子詳細はほとんど不明である6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19.免疫細胞の調節および機能に関与する因子の中で、microRNA(miRNA)は、遺伝子発現後に転写的に調節する短い非コードRNA、主要な細胞経路(すなわち、増殖、分化、発達、およびアポトーシス)20の文脈において重要な役割を果たすることが示されている。これらの分子は、マクロファージ21の機能的分極化を指示するために不可欠な転写因子の重要な調節因子として記載されている。cARTを受けているHIV感染者からの単球におけるmiRNAの潜在的な役割が調査されているが、現場での進歩は、はるかに多くの作業を必要とする22、23、24、25、26。本論文では、HIVに感染した患者と対照からmiRNAとsiRNAを原発性ヒト単球にトランスフェクトする最適化された方法について論じる。

このプロトコルは、技術的な手順の連続性は臨床サンプルを扱うときに不要な実験変数を排除するのに役立つため、市販の試薬およびキットに依存しています。それにもかかわらず、この方法は、重要なヒント(すなわち、プレートへの細胞の付着を促進するために無血清媒体を用いためっきまたは短時間のインキュベーションの細胞数)を提供する。さらに、このプロトコルで使用される偏光条件は、公開された作品27、28、29に由来する。

Protocol

以下に説明するすべての方法は、ルイジアナ州立大学健康科学センターニューオーリンズ機関審査委員会によって承認されています.インフォームド・コンセントを得た後、すべての血液を採取した。 注:全手順は、生物学的材料の処理に注意が必要になるように、バイオセーフティレベル2(BSL2)施設の滅菌条件下で行われます。特に、各工程は、バイオセーフティキャビ?…

Representative Results

記載された手順を用いて、HIV感染者および健康なドナーからの原発性ヒト単球を単離した。ここで提示されたすべてのデータは、低い(<20コピー/mL)または検出不能なウイルス負荷と通常のCD4+T細胞数を有するcARTを受けているHIV+被験者から得られた。単離直後に細胞を染色し、フローサイトメトリーを行い、細胞集団の純度を確認した。結果は、>97%の?…

Discussion

提示されたプロトコルは、単球およびマクロファージを研究するためのモデルとしてHIV感染被験者からの一次細胞の使用を示す。HIV+cARTを受けている患者は、何年も感染症と共に生きており、また、侵害された免疫系に関連する他の共感染を持つことができます。HIV慢性感染の存在下で免疫調節を研究するために、細胞を患者から直接採取した。miRNAが細胞の発達と分化に大きな役割?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、患者サンプルを提供するためのHIV臨床/腫瘍バイオレポジトリコアと、フローサイトメトリー分析を提供するための細胞免疫学代謝コアに感謝したいと考えています。このプロジェクトは、NIH P20GM121288とP30GM114732によって資金提供されました。

Materials

0.5M EDTA Invitrogen AM9260G
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA BD Biosciences 366643
Brilliant Stain Buffer BD Horizon 563794 Flow cytometry
CD14 PerCP Invitrogen 46-0149-42 Flow cytometry- conjugated antibody
CD163 BV711 BD Horizon 563889 Flow cytometry- conjugated antibody
CD209 BV421 BD Horizon 564127 Flow cytometry- conjugated antibody
CD80 FITC BD Horizon 557226 Flow cytometry- conjugated antibody
CD83 APC BD Horizon 551073 Flow cytometry- conjugated antibody
Easy 50 EasySep Magnet StemCell Technologies 18002
Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit StemCell Technologies 19669
EIF4EBP1 mAb Cell Signaling 9644 Monoclonal antibody for Western blot
EIF4EBP1 siRNA Santa Cruz sc-29594
Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated Hyclone SH30070.03HI
Gallios Flow Cytometer Beckman Coulter B43618
GAPDH mAb Santa Cruz SC-47724 Monoclonal antibody for Western blot
HuFcR Binding Inhibitor eBiosciences 14-9161-73 Flow cytometry- blocking buffer
Kaluza Analysis Software Beckman Coulter B16406 Software to analyze flow cytometry data
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5 Sigma L4524
miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p Qiagen YM00472124
MISSION miRNA Negative Control Sigma HMC0002 Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye
Nunc 35mm Cell Culture Dish Thermo Scientific 150318
PBS Gibco 20012027
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Recombinant Human GM-CSF R&D Systems 215-GM-050
Recombinant Human IFN-γ R&D Systems 285-IF-100
Recombinant Human IL-4 R&D Systems 204-IL-010
Recombinant Human M-CSF R&D Systems 216-MC-025
RPMI 1640 with L-Glutamine Corning 10040CVMP
Scrambled Control siRNA Santa Cruz sc-37007
Viromer Blue Transfection Reagent Kit Lipocalyx VB-01LB-01
WST-1 Cell Proliferation Reagent Roche 5015944001 Colorimetric assay to assess cell viability

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Cite This Article
Plaisance-Bonstaff, K., Faia, C., Wyczechowska, D., Jeansonne, D., Vittori, C., Peruzzi, F. Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes. J. Vis. Exp. (154), e59967, doi:10.3791/59967 (2019).

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