Modelo calvarial de aumento ósseo em coelho para avaliação do crescimento ósseo e neovascularização em materiais de substituição óssea

Summary

Aqui nós apresentamos um protocolo cirúrgico nos coelhos com o objetivo avaliar materiais da substituição do osso nos termos de capacidades da regeneração do osso. Usando cilindros PEEK fixados em crânios de coelhos, osteocondução, osteoindução, osteogênese e vasculogênese induzida pelos materiais podem ser avaliados tanto em animais vivos ou eutanasiados.

Abstract

O princípio básico do modelo calvarial coelho é crescer novo tecido ósseo verticalmente em cima da parte cortical do crânio. Este modelo permite a avaliação de materiais de substituição óssea para a regeneração óssea oral e craniofacial em termos de crescimento ósseo e suporte de neovascularização. Uma vez que os animais são anestesiados e ventilados (intubação endotraqueal), quatro cilindros feitos de éter cetona de poliéter (PEEK) são parafusados no crânio, em ambos os lados das suturas mediana e coronal. Cinco furos Intramedullary são perfurados dentro da área do osso delimitada por cada cilindro, permitindo o afluxo de pilhas da medula. As amostras de material são colocadas nos cilindros que são fechados então. Finalmente, o local cirúrgico é suturado, e os animais são despertares. O crescimento ósseo pode ser avaliado em animais vivos usando microtomografia. Uma vez que os animais são eutanasiados, o crescimento ósseo e a neovascularização podem ser avaliados por meio de microtomografia, imunofluorescência e imunohistologia. Como a avaliação de um material exige a padronização e a calibração máximas, o modelo calvarial parece ideal. O acesso é muito fácil, a calibração e a padronização são facilitadas pelo uso de cilindros definidos e quatro amostras podem ser avaliadas simultaneamente. Além disso, a tomografia ao vivo pode ser usada e, finalmente, uma grande diminuição nos animais a serem eutanasiados pode ser antecipada.

Introduction

O modelo calvarial de aumento ósseo foi desenvolvido na 90 ‘ s com o objetivo de otimizar o conceito de regeneração óssea guiada (GBR) no domínio cirúrgico oral e craniofacial. O princípio básico deste modelo é crescer o tecido ósseo novo verticalmente em cima da parte cortical do crânio. Para isso, um reator (por exemplo, titânio-cúpula,-cilindro ou gaiola) é fixado no crânio para proteger a regeneração óssea conduzida por um enxerto (por exemplo, hidrogel, substituto ósseo, etc.). Com o auxílio deste modelo, gaiolas de titânio ou cerâmica^1,2,3,4,5,6, membranas GBR^{7,8,9 ,10}, fatores osteogênicos^{11,12,13,14,15,16,17}, osso novo substitutos¹²,^{16,17,18,19,20,21,22,23 , 24} de cada ^{, 25} anos de ^{, 26} anos de ^{, 27} anos de ^{, 28} anos de ^{, 29} ou o mecanismo de neovascularização durante o processo de regeneração óssea³⁰ foram avaliados.

Do ponto de vista translacional, o modelo calvarial representa um defeito de uma parede que pode ser comparado a um defeito de classe IV na mandíbula³¹. O objetivo é crescer o osso novo acima de uma área cortical, sem nenhum apoio lateral das paredes endógenas do osso. O modelo é assim extremamente estrito e avalia o potencial real da osteocondução vertical sobre a parte cortical do osso. Se o modelo aqui descrito se dedica principalmente à avaliação da osteocondução em substitutos ósseos, a osteogênese e/ou a osteoindução também podem ser avaliadas, bem como a vasculogênese^1,2,^{3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30}.

Essencialmente para razões éticas, práticas e econômicas, o modelo calvarial foi desenvolvido no coelho em que o metabolismo e a estrutura do osso são completamente relevantes quando comparado ao³²humano. Das 30 referências citadas acima, 80% utilizaram o modelo calvarial de coelho^{1,2,3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15,17,22, 23},^{26,27,28,29,30,33}, demonstrando assim a relevância deste modelo animal. Em 2008, o grupo Busenlechner transferiu o modelo calvarial para o porco, para permitir a comparação de oito substitutos ósseos simultaneamente²⁰ (em comparação com dois substitutos ósseos com o coelho). Por outro lado, nosso grupo transferiu o modelo calvarial de coelhos para ovelhas. Em resumo, as abóbadas Titanium foram coloc em crânios dos carneiros para caracterizar o osteocondução de um substituto 3D-impresso novo do osso. Esses estudos nos permitiram desenvolver e dominar o modelo calvarial e sua análise^16,17.

Os três últimos estudos citados¹⁶,^20,21, juntamente com várias outras investigações^{12,17,18,19,22, 23},^24,26,^27,28,²⁹, confirmaram o grande potencial do modelo calvarial como uma triagem e caracterização Modelo. Entretanto, embora os resultados obtidos tenham sido bastante satisfatórios, também apontaram algumas limitações: (1) o uso de abóbadas de titânio, que impediram a difusão de raios X e, por sua vez, o uso de microtc ao vivo. Estes não puderam ser removidos antes do processamento histológico, forçando os pesquisadores a incorporar as amostras em resina poli (metacrilato de metilo) (PMMA). As análises resultantes foram, portanto, largamente limitadas à topografia. (2) custos financeiros elevados, especialmente devido ao custo dos animais, e custos relacionados com a logística, manutenção e cirurgia dos animais. (3) dificuldades para obter aprovações éticas para grandes animais.

Um estudo recente de Polo, et al.²⁶ melhorou em grande parte o modelo no coelho. As abóbadas Titanium foram substituídas por cilindros closable que poderiam ser enchidas com um volume constante de material. Quatro destes cilindros foram colocados em crânios de coelhos. Na conclusão, os cilindros podiam ser removidos de modo que as biópsias fossem metal-livres, introduzindo muito mais flexibilidade a respeito do processamento da amostra. O modelo calvarial do coelho tornou-se atrativo para o teste simultâneo com uns mais baixos custos, manipulação animal fácil e facilitação do processamento da amostra. Aproveitando-se destes desenvolvimentos recentes, nós melhoramos mais o modelo substituindo o titânio com o auge para produzir cilindros, permitindo desse modo a difusão do raio X e o uso do microtomografia em animais vivos.

Neste artigo, descreveremos os processos de anestesia e cirurgia e mostraremos exemplos de saídas que podem ser obtidas utilizando este protocolo, ou seja, (imuno-) histologia, Histomorfometria, microtomografia ao vivo e ex vivo para avaliar os mecanismos do osso regeneração e quantificar a nova síntese óssea apoiada por materiais substitutos ósseos.

Protocol

Em consonância com as exigências jurídicas suíças, o protocolo foi aprovado por um comitê acadêmico e supervisionado pelas agências veterinárias cantonal e federal (autorizações n ° GE/165/16 e GE/100/18). 1. dispositivos e animais específicos Cilindros Cilindros de máquina com abas estabilizadoras laterais de PEEK para ter diâmetro interno de 5 mm, diâmetro externo de 8 mm e uma altura de 5 mm (Figura 1)….

Representative Results

O modelo aqui descrito dedica-se à avaliação da osteocondução em substitutos ósseos. Osteogénese e-ou osteoindução de substitutos ósseos (pre-) Cellularized ou carregado com as moléculas bioativos podem igualmente ser avaliados, assim como o vasculogênese1,2,3,4, 5. º , 6 anos de …

Discussion

O modelo aqui descrito é simples e deve ser desenvolvido com bastante facilidade, desde que todos os passos sejam seguidos e o equipamento seja adequado. Como o protocolo descrito é um método cirúrgico, todas as etapas aparecem críticas e devem ser seguidas corretamente. É fundamental ser treinado para experimentos com animais, especialmente em manuseio de coelhos e anestesia. Não hesite em pedir anestesista profissional e ajuda veterinária. É crítico insistir na monitoração Visual diária dos animais antes e…

Materials

Drugs
Enrofloxacine Baytril 10%	Bayer		Antibiotic
Fentanyl	Bischel		For analgesia
Ketalar 50mg/ml	Pfizer		Ketamine for anesthesia
Lidohex	Bichsel		Lubricating gel for the eyes
Opsite	Smith and Nephew	66004978	Sprayable dressing
Povidone iodine 10%, Betadine	Mundipharma		anti-infective agent
Propofol 2%	Braun	3538710	For anesthesia
Rapidocain 2%	sintetica		Local anesthesia
Ringer-acetate	Fresenius Kabi		Volume compensation
Rompun 2%	Bayer		Xylazin for anesthesia
Sevoflurane 5%	Abbvie		For anesthesia
Sterile saline	Sintetica
Temgesic	Reckitt Benckiser		Buprenorphine hydrochloride, analgesia
Thiopental Inresa	Ospediala		For anesthesia
Xylocaine 10% spray	Astra Zeneca		For intubation
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Fresenius Vial pilot C	Imexmed		Infusion pump
Heated pad	Harvard Apparatus
Suction dominant 50	Medela
Suction tubing Optimus	Promedical	80342.2
Surgical motor	Schick dental	Qube	Drilling of intramedullary holes
Ventilation	Maquet Servo1
Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
Cylinders and caps	Boutyplast	Customized	composition: PEEK (poly ether ether ketone)
Manual self-retaining shaft	GlobalD	ACT1K
Mobile handle for self-retaining shaft	GlobalD	MTM
Self- drilling screws	GlobalD	VA1.2KL4	cross-drive screws composed by Titanium grade5, ISO 5832-3
Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical tray
Endotracheal tube Shiley diameter 2,5mm	Covidien	86233	For intubation
Endotracheal tube Shiley diameter 4,9mm	Covidien	107-35G	For intubation
Ethicon prolene 4-0	Ehticon	8581H	Non-resorbable suture
Forceps	Marcel Blanc	BD027R	145 mm
Intubation catheter	Cook medical		Guide for intubation
Needlle holder	Marcel Blanc	BM008R
Needles BD Microlance3	Becton Dickinson	300300/304622	26G; 18G
Periosteal	HU-Friedy	P9X
Round surgical burs	Patterson	78000	0.8 mm in diameter, Drilling of intramedullary holes
Scalpel	Swann-Morton		n°10 and n°15
Scissors	Marcel Blanc	00657	180 mm
Syringes Omnifix	Braun	4616057V	5ml, 10ml and 50ml
Venflon G22	Braun	42690985-01	Vasofix safety for the ear iv line