Lentiviral CRISPR/Cas9-मध्यस्थता जीनोम संपादन रोग मॉडल में Hematopoietic कोशिकाओं के अध्ययन के लिए
Summary
CRISPR/Cas9 प्रणाली द्वारा यूरीन हेमेटोपोएटिक स्टेम और जनक कोशिकाओं (एचएसपीसी) के अत्यधिक कुशल जीनोम संपादन के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है ताकि हेमटोपोएटिक सिस्टम-विशिष्ट जीन संशोधनों के साथ माउस मॉडल सिस्टम को तेजी से विकसित किया जा सके।
Abstract
पारंपरिक ट्रांसजेनेसिस दृष्टिकोण का उपयोग कर hematopoietic स्टेम कोशिकाओं में जीन हेरफेर समय लेने वाली, महंगा, और चुनौतीपूर्ण हो सकता है. जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी और lentivirus मध्यस्थता transgene वितरण प्रणाली में अग्रिमों से लाभ, एक कुशल और किफायती विधि यहाँ वर्णित है कि चूहों जिसमें जीन hematopoietic स्टेम कोशिकाओं में विशेष रूप से हेरफेर कर रहे हैं स्थापित करता है. Lentiviruses एक गाइड आरएनए (GRNA) विशिष्ट जीन और एक लाल फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन (RFP) को लक्षित के साथ Cas9-expressing वंश-नकारात्मक अस्थि मज्जा कोशिकाओं ट्रांसड्यूस करने के लिए उपयोग किया जाता है, तो इन कोशिकाओं घातक विकिरणC57BL/6 चूहों में प्रत्यारोपित कर रहे हैं। गैर-लक्ष्यीकृत GRNA व्यक्त lentivirus के साथ प्रत्यारोपित चूहे नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है. ट्रांसड्यूस्ड हेमेटोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं के engraftment परिधीय रक्त के आरएफपी सकारात्मक ल्यूकोसाइट्स के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन किया जाता है। इस विधि का उपयोग करना, $90% माइलॉयड कोशिकाओं के transduction और प्रत्यारोपण के बाद 4 सप्ताह में लसीकाभ कोशिकाओं के 70% प्राप्त किया जा सकता है. जीनोमिक डीएनए आरएफपी-सकारात्मक रक्त कोशिकाओं से अलग है, और लक्षित साइट डीएनए के कुछ हिस्सों को पीसीआर द्वारा जीनोम संपादन को मान्य करने के लिए बढ़ाया जाता है। इस प्रोटोकॉल hematopoiesis-नियामक जीन के एक उच्च throughput मूल्यांकन प्रदान करता है और hematopoietic सेल भागीदारी के साथ माउस रोग मॉडल की एक किस्म के लिए बढ़ाया जा सकता है.
Introduction
हेमेटोपोईटिक सिस्टम-विशिष्ट क्रे ड्राइवरों जैसे Mx1-Cre, Vav-Cre, और अन्य का उपयोग करने वाले पारंपरिक और सशर्त ट्रांसजेनिक/नॉक-आउट चूहों सहित आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों की उपलब्धता पर कई अध्ययन निर्भर करते हैं। 1,2,3,4,5. इन रणनीतियों के लिए नए माउस उपभेदों की स्थापना की आवश्यकता होती है, जो समय लेने वाली और आर्थिक रूप से बोझ हो सकती है। जबकि जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में क्रांतिकारी प्रगति ने उपयुक्त तकनीकी विशेषज्ञता6,7,8,9 के साथ कम से कम 3-4 महीनों में नए माउस उपभेदों की पीढ़ी को सक्षम किया है , प्रयोगों का अनुसरण करने से पहले माउस कॉलोनी को बढ़ाना अधिक समय की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, इन प्रक्रियाओं महंगा कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, जैक्सन प्रयोगशाला दस्तक बाहर चूहों पीढ़ी सेवाओं की वर्तमान कीमत की सूची में $ 16,845 प्रति तनाव (दिसंबर 2018 के रूप में). इस प्रकार, तरीकों कि पारंपरिक murine ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण की तुलना में अधिक किफायती और कुशल हैं और अधिक लाभप्रद हैं.
क्लस्टर्ड नियमित रूप से अंतराल वाले लघु पैलिड्रोमिक दोहराता/CRISPR संबद्ध प्रोटीन 9 (CRISPR/Cas9) प्रौद्योगिकी ने तीव्र और कुशल आरएनए-आधारित, अनुक्रम-विशिष्ट जीनोम संपादन के लिए नए उपकरणों का विकास किया है। मूल रूप से हमलावर रोगज़नक़ डीएनए को नष्ट करने के लिए एक जीवाणु अनुकूली प्रतिरक्षा तंत्र के रूप में की खोज की, CRISPR/Cas9 प्रणाली एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया गया है यूकैरियोटिक कोशिकाओं और पशु मॉडल में जीनोम संपादन की प्रभावशीलता को बढ़ाने के लिए. CRISPR/Cas9 मशीनरी को हेमेटोपोएटिक स्टेम सेल (यानी, इलेक्ट्रोपोरिओशन, नाभिक, लिपोफेक्शन, वायरल डिलीवरी, और अन्य) में संचारित करने के लिए कई दृष्टिकोणों को नियोजित किया गया है।
यहाँ, एक lentivirus प्रणाली को प्रभावी ढंग से Cas9-expressing murine hematopoietic स्टेम कोशिकाओं को संक्रमित करने की क्षमता के कारण कोशिकाओं ट्रांसड्यूस करने के लिए कार्यरत है और एक साथ गाइड आरएनए अभिव्यक्ति का निर्माण पैकेज, प्रमोटरों, नियामक दृश्यों, और जीन है कि एन्कोकोड फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन (यानी, GFP, आरएफपी). इस विधि का उपयोग करते हुए, माउस हेमेटोपोएटिक स्टेम कोशिकाओं के पूर्व विवो जीन संपादन हासिल किया गया है, घातक विकिरणित चूहों में अस्थि मज्जा के सफल पुनर्गठन के बाद10. इस अध्ययन के लिए कार्यरत lenivirus वेक्टर एक आंतरिक राइबोसोमल प्रवेश साइट रिपोर्टर जीन से ऊपर के साथ आम कोर EF1a प्रमोटर से Cas9 और GFP रिपोर्टर जीन व्यक्त करता है. गाइड आरएनए अनुक्रम एक अलग U6 प्रमोटर से व्यक्त की है. इस प्रणाली तो उम्मीदवार क्लोनल hematopois ड्राइवर जीन Tet2 और Dnmt3a10में प्रविष्टि और विलोपन उत्परिवर्तन बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है . हालांकि, इस विधि द्वारा transduction दक्षता अपेक्षाकृत कम है ($5%-10%) वेक्टर डालने के बड़े आकार के कारण (13 Kbp) कि transduction दक्षता सीमा और उत्पादन के दौरान वायरस titer कम कर देता है.
अन्य अध्ययनों में, यह दिखाया गया है कि बड़ा वायरल आरएनए आकार नकारात्मक दोनों वायरस उत्पादन और transduction दक्षता को प्रभावित करता है. उदाहरण के लिए, सम्मिलित आकार में 1 केबी वृद्धि से वायरस के उत्पादन में $50% की कमी आई है, और ट्रांसडक्शन दक्षता माउस हेमेटोपोएटिक स्टेम सेल11में 50% से अधिक तक कम हो जाएगी। इस प्रकार, यह प्रणाली की दक्षता में सुधार करने के लिए संभव के रूप में ज्यादा वायरल डालने के आकार को कम करने के लिए फायदेमंद है।
इस कमी को Cas9 ट्रांसजेनिक चूहों को रोजगार देकर दूर किया जा सकता है, जिसमें Cas9 प्रोटीन या तो एक संरचक या प्रेरक तरीके से व्यक्त किया जाता है12. गठन CRISPR/Cas9 दस्तक में चूहों एक सर्वव्यापी तरीके से Rosa26 स्थानों पर कैग प्रमोटर से Cas9 endonuclease और EGFP व्यक्त करता है. इस प्रकार, कोर EF1a प्रमोटर के नियंत्रण में U6 प्रमोटर और आरएफपी रिपोर्टर जीन के नियंत्रण में sgRNA के साथ एक निर्माण जीनोम संपादन प्राप्त करने के लिए lentivirus वेक्टर का उपयोग कर वितरित किया जा सकता है. इस प्रणाली के साथ, hematopoietic स्टेम कोशिकाओं के जीन सफलतापूर्वक संपादित किया गया है, एक $90% transduction दक्षता दिखा. इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल चूहों को बनाने के लिए एक त्वरित और प्रभावी तरीका प्रदान करता है जिसमें लक्षित जीन उत्परिवर्तनों को हेमेटोपोएटिक प्रणाली में पेश किया जाता है। जबकि हमारी प्रयोगशाला मुख्य रूप से हृदय रोग प्रक्रियाओं में क्लोनहेमितोपोसिस की भूमिका का अध्ययन करने के लिए इस प्रकार की प्रौद्योगिकी का उपयोग कर रही है13,14,15, यह भी रुमटोलॉजिकल के अध्ययन के लिए लागू होता है द्रोह16| इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल कैसे HSPC में डीएनए उत्परिवर्तन ों hematopoietic प्रणाली में अन्य रोग या विकासात्मक प्रक्रियाओं को प्रभावित के विश्लेषण के लिए बढ़ाया जा सकता है.
एक मजबूत मसूरी वायरस वेक्टर सिस्टम स्थापित करने के लिए, उच्च टिटर वायरल स्टॉक और हेमेटोपोएटिक कोशिकाओं के ट्रांसडक्शन और प्रत्यारोपण के लिए अनुकूलित शर्तों की आवश्यकता है। प्रोटोकॉल में, अनुभाग 1 में एक उच्च टिटर वायरल स्टॉक की तैयारी पर निर्देश दिए गए हैं, खंड 2 में murine hematopoietic स्टेम कोशिकाओं की संस्कृति की स्थिति का अनुकूलन, खंड 3 में अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के लिए तरीके, और आकलन अनुभाग 4 में engraftment.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल का लाभ पारंपरिक माउस ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण की तुलना में एक तेजी से और अत्यधिक लागत प्रभावी तरीके से hematopoietic कोशिकाओं में विशिष्ट उत्परिवर्तनों शरण पशु मॉडल का निर्माण है. यह पाया गया कि इस ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एस एस एक अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन postdoctoral फैलोशिप 17POST33670076 द्वारा समर्थित किया गया था. के डब्ल्यू NIH अनुदान R01 HL138014, R01 HL141256, और R01 HL139819 द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| 1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | general supply |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216– | Cell line |
| APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21) | BD Biosciences | 560599 | Antibodies |
| APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2) | BD Biosciences | 552094 | Antibodies |
| BD Luer-Lok disposable syringes, 10 ml | BD | 309604 | general supply |
| BD Microtainer blood collection tubes, K2EDTA added | BD Bioscience | 365974 | general supply |
| BD Precisionglide needle, 18 G | BD | 305195 | general supply |
| BD Precisionglide needle, 22 G | BD | 305155 | general supply |
| BV510-anti-mouse CD8a (Clone 53-6.7) | Biolegend | 100752 | Antibodies |
| BV711-anti-mouse CD3e (Clone 145-2C11) | Biolegend | 100349 | Antibodies |
| Collagen from calf skin | Sigma-Aldrich | 9007-34-5 | general supply |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well | Millipore Sigma | CLS3471 | general supply |
| CRISPR/Cas9 knock-in mice | The Jackson Laboratory | 028555 | mouse |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | general supply |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose | Sigma Aldrich | D6429 | Medium |
| eBioscience 1X RBC Lysis Buffer | Thermo fisher Scientific | 00-4333-57 | Solution |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Life Sciences | 353003 | general supply |
| Falcon 5 mL round bottom polystyrene test tube | Life Sciences | 352054 | general supply |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352098 | general supply |
| Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate | Life Science | 353046 | general supply |
| Fisherbrand microhematocrit capillary tubes | Thermo Fisher Scientific | 22-362566 | general supply |
| Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | general supply |
| FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5) | Invitrogen | 11-0042-85 | Antibodies |
| Fixation Buffer | BD Bioscience | 554655 | Solution |
| Guide-it Compete sgRNA Screening Systems | Clontech | 632636 | Kit |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein | 29404 | Solution |
| Lenti-X qRT-PCR Titration Kit | Takara | 631235 | Kit |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | Kit |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 mm | Millipore Sigma | SLHV004SL | general supply |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
| PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98) | eBioscience | 25-1152-82 | Antibodies |
| PEI MAX | Polysciences | 24765-1 | Solution |
| Penicillin-Streptomycin Mixture | Lonza | 17-602F | Solution |
| PerCP-Cy5.5-anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Biosciences | 560602 | Antibodies |
| pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP | Addgene | 57823 | Plasmid |
| pMG2D | Addgene | 12259 | Plasmid |
| Polybrene Infection/Transfection Reagent | Sigma Aldrich | TR-1003-G | Solution |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 326823 | general supply |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | Plasmid |
| RadDisk – Rodent Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | general supply |
| Recombinant Murine SCF | Peprotech | 250-03 | Solution |
| Recombinant Murine TPO | Peprotech | 315-14 | Solution |
| StemSpan SFEM | STEMCELL Technologies | 09600 | Solution |
| TOPO TA cloning kit for sequencing with One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli | Thermo fisher Scientific | K457501 | Kit |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend | 423102 | Solution |
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