Lentiviral CRISPR/Cas9-medierad genom redigering för studiet av hematopoietiska celler i sjukdomsmodeller
Summary
Beskrivna är protokoll för mycket effektiv genom redigering av murina hematopoietiska Stem och stamceller (HSPC) av CRISPR/Cas9 systemet för att snabbt utveckla musmodell system med hematopoietiska systemspecifika genmodifieringar.
Abstract
Manipulera gener i hematopoietiska stamceller med hjälp av konventionella transgenetik metoder kan vara tidskrävande, dyrt och utmanande. Dra nytta av framsteg i genom redigering teknik och lentivirus-medierade transgenens leveranssystem, en effektiv och ekonomisk metod beskrivs här som etablerar möss där gener manipuleras specifikt i hematopoietiska stamceller. Lentivirus används för att transduce Cas9-uttrycker härstamning-negativa benmärgsceller med en guide RNA (gRNA) inriktning på specifika gener och en röd fluorescens reporter gen (RFP), då dessa celler transplanteras till lethally-bestrålade C57BL/6 möss. Möss som transplanteras med lentivirus som uttrycker icke-riktad gRNA används som kontroller. Engrafering av sensorik hematopoietiska stamceller utvärderas genom flödescytometrisk analys av RFP-positiva leukocyter av perifert blod. Med denna metod, ~ 90% transduktion av myeloida celler och ~ 70% av lymfoida celler vid 4 veckor efter transplantation kan uppnås. Genomiskt DNA isoleras från RFP-positiva blodceller, och delar av det riktade DNA-området förstärks av PCR för att validera genomedigering. Detta protokoll ger en hög genomströmning utvärdering av hematopoies-reglerande gener och kan utvidgas till en mängd olika modeller mus sjukdom med hematopoietisk cell inblandning.
Introduction
Många studier i hematologi och immunologi förlitar sig på tillgången på genetiskt modifierade möss, inklusive konventionella och villkorliga transgena/knock-out möss som utnyttjar hematopoietiska systemspecifika CRE förare såsom Mx1-CRE, VAV-CRE, och andra 1,2,3,4,5. Dessa strategier kräver inrättandet av nya mus stammar, vilket kan vara tidskrävande och ekonomiskt belastande. Medan revolutionära framsteg i genom redigering teknik har möjliggjort generering av nya möss stammar i så få som 3-4 månader med lämplig teknisk expertis6,7,8,9 , mycket mer tid krävs för att förstärka musen kolonin innan experiment eftersträvas. Dessutom är dessa förfaranden kostsamma. Till exempel listar Jackson Laboratory det nuvarande priset på Knock-out möss generation tjänster på $16 845 per stam (från och med december 2018). Således är metoder som är mer ekonomiska och effektiva än konventionella murina transgena metoder mer fördelaktiga.
Kluster med jämna mellanrum korta palindrom repetitioner/CRISPR Associated protein 9 (CRISPR/Cas9) teknik har lett till utveckling av nya verktyg för snabb och effektiv RNA-baserad, sekvens-specifik genomredigering. Ursprungligen upptäcktes som en bakteriell adaptiv immunmekanism för att förstöra invaderande patogen DNA, den CRISPR/Cas9 systemet har använts som ett verktyg för att öka effektiviteten av genomredigering i eukaryota celler och djurmodeller. Ett antal metoder har använts för att överföra CRISPR/Cas9 maskiner till hematopoietiska stamceller (dvs., elektroporation, nukleofektion, lipofektion, viral leverans, och andra).
Här är ett lentivirus system används för att transduce celler på grund av dess förmåga att effektivt infektera Cas9-uttrycker murina hematopoietiska stamceller och paketera tillsammans guide RNA uttryck konstruera, initiativtagare, regulatoriska sekvenser, och gener som kodar fluorescerande reporter proteiner (dvs., GFP, RFP). Med denna metod har ex vivo genredigering av mus hematopoietiska stamceller uppnåtts, följt av framgångsrik beredning av benmärg i dödligt bestrålade möss10. Den lentivirus Vector används för denna studie uttrycker Cas9 och GFP reporter gener från den gemensamma kärnan EF1a promotorn med en intern ribosomal inträde webbplats uppströms från reportern genen. Guide-RNA-sekvensen uttrycks från en separat U6-promotor. Detta system används sedan för att skapa införande och radering mutationer i kandidat klon hematopoies föraren gener Tet2 och Dnmt3a10. Dock är transduktionseffektiviteten med denna metod relativt låg (~ 5%-10%) på grund av den stora storleken på Vector insatsen (13 KBP) som begränsar transduktionseffektiviteten och reducerar virusets titer under produktionen.
I andra studier, det har visats att större viral RNA-storlek negativt påverkar både virus produktion och signaltransduktion effektivitet. Till exempel, en 1 KB ökning av skär storlek rapporteras att minska virus produktionen av ~ 50%, och transduktion effektivitet kommer att minska till mer än 50% i mus hematopoietiska stamceller11. Därför är det fördelaktigt att minska storleken på virus insatsen så mycket som möjligt för att förbättra systemets effektivitet.
Denna brist kan övervinnas genom att anställa Cas9 transgena möss, där Cas9 proteinet uttrycks i antingen ett konstitutivt eller inducerbart sätt12. De konstitutiva CRISPR/Cas9-Knock-in-möss uttrycker Cas9 endonukleas och EGFP från CAG-promotorn på Rosa26 Locus på ett allestädande sätt. Således, en konstruktion med sgRNA under kontroll av U6 promotorn och RFP reporter genen under kontroll av Core EF1a promotorn kan levereras med hjälp av lentivirus vektorn för att uppnå genomredigering. Med detta system har gener av hematopoietiska stamceller framgångsrikt redigerats, visar en ~ 90% signaltransduktion effektivitet. Detta protokoll ger således en snabb och effektiv metod för att skapa möss där riktade genmutationer introduceras i det hematopoietiska systemet. Medan vårt labb huvudsakligen använder denna typ av teknik för att studera den roll som klonala hematopoies i hjärt-kärlsjukdomar processer13,54,15, det är också tillämplig på studier av hematologiska malignitet16. Dessutom kan detta protokoll utvidgas till analysen av hur DNA-mutationer i HSPC påverkar andra sjukdoms-eller utvecklingsprocesser i det hematopoietiska systemet.
För att etablera ett robust lentivirus Vector system, hög titer viral lager och optimerade villkor för transduktion och transplantation av hematopoietiska celler krävs. I protokollet ges instruktioner om beredning av en hög titervirusstock i avsnitt 1, optimering av odlingsförhållandena för murina hematopoietiska stamceller i avsnitt 2, metoder för benmärgstransplantation i avsnitt 3 och bedömning av inympelse i avsnitt 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fördelen med detta protokoll är skapandet av djurmodeller härda specifika mutationer i hematopoietiska celler på ett snabbt och mycket kostnadseffektivt sätt jämfört med konventionella mus transgena metoder. Det konstaterades att denna metod möjliggör generering av möss med hematopoietiska cell gen-manipulationer inom 1 månad. Det finns flera kritiska steg i detta protokoll som kräver ytterligare övervägande.
Screening av gRNA-sekvens
…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S. S. stöddes av ett amerikanskt hjärta Association postdoktor Fellowship 17POST33670076. K. W. stöddes av NIH Grants R01 HL138014, R01 HL141256, och R01 HL139819.
Materials
| 1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | general supply |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216– | Cell line |
| APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21) | BD Biosciences | 560599 | Antibodies |
| APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2) | BD Biosciences | 552094 | Antibodies |
| BD Luer-Lok disposable syringes, 10 ml | BD | 309604 | general supply |
| BD Microtainer blood collection tubes, K2EDTA added | BD Bioscience | 365974 | general supply |
| BD Precisionglide needle, 18 G | BD | 305195 | general supply |
| BD Precisionglide needle, 22 G | BD | 305155 | general supply |
| BV510-anti-mouse CD8a (Clone 53-6.7) | Biolegend | 100752 | Antibodies |
| BV711-anti-mouse CD3e (Clone 145-2C11) | Biolegend | 100349 | Antibodies |
| Collagen from calf skin | Sigma-Aldrich | 9007-34-5 | general supply |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well | Millipore Sigma | CLS3471 | general supply |
| CRISPR/Cas9 knock-in mice | The Jackson Laboratory | 028555 | mouse |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | general supply |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose | Sigma Aldrich | D6429 | Medium |
| eBioscience 1X RBC Lysis Buffer | Thermo fisher Scientific | 00-4333-57 | Solution |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Life Sciences | 353003 | general supply |
| Falcon 5 mL round bottom polystyrene test tube | Life Sciences | 352054 | general supply |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352098 | general supply |
| Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate | Life Science | 353046 | general supply |
| Fisherbrand microhematocrit capillary tubes | Thermo Fisher Scientific | 22-362566 | general supply |
| Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | general supply |
| FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5) | Invitrogen | 11-0042-85 | Antibodies |
| Fixation Buffer | BD Bioscience | 554655 | Solution |
| Guide-it Compete sgRNA Screening Systems | Clontech | 632636 | Kit |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein | 29404 | Solution |
| Lenti-X qRT-PCR Titration Kit | Takara | 631235 | Kit |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | Kit |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 mm | Millipore Sigma | SLHV004SL | general supply |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
| PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98) | eBioscience | 25-1152-82 | Antibodies |
| PEI MAX | Polysciences | 24765-1 | Solution |
| Penicillin-Streptomycin Mixture | Lonza | 17-602F | Solution |
| PerCP-Cy5.5-anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Biosciences | 560602 | Antibodies |
| pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP | Addgene | 57823 | Plasmid |
| pMG2D | Addgene | 12259 | Plasmid |
| Polybrene Infection/Transfection Reagent | Sigma Aldrich | TR-1003-G | Solution |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 326823 | general supply |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | Plasmid |
| RadDisk – Rodent Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | general supply |
| Recombinant Murine SCF | Peprotech | 250-03 | Solution |
| Recombinant Murine TPO | Peprotech | 315-14 | Solution |
| StemSpan SFEM | STEMCELL Technologies | 09600 | Solution |
| TOPO TA cloning kit for sequencing with One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli | Thermo fisher Scientific | K457501 | Kit |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend | 423102 | Solution |
References
- Sasaki, Y., et al. Defective immune responses in mice lacking LUBAC-mediated linear ubiquitination in B cells. EMBO Journal. 32, 2463-2476 (2013).
- Ogilvy, S., et al. Transcriptional regulation of vav, a gene expressed throughout the hematopoietic compartment. Blood. 91, 419-430 (1998).
- Meyer, S. E., et al. DNMT3A Haploinsufficiency Transforms FLT3ITD Myeloproliferative Disease into a Rapid, Spontaneous, and Fully Penetrant Acute Myeloid Leukemia. Cancer Discovery. 6, 501-515 (2016).
- Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269, 1427-1429 (1995).
- Cole, C. B., et al. PML-RARA requires DNA methyltransferase 3A to initiate acute promyelocytic leukemia. Journal of Clinical Investigation. 126, 85-98 (2016).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, 1370-1379 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18, 92 (2017).
- Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knock-out mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13, 195-215 (2018).
- Sano, S., et al. CRISPR-Mediated Gene Editing to Assess the Roles of Tet2 and Dnmt3a in Clonal Hematopoiesis and Cardiovascular Disease. Circulation Research. 123, 335-341 (2018).
- Cante-Barrett, K., et al. Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: size matters. BMC Research Notes. 9 (312), (2016).
- Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 12514-12519 (2016).
- Fuster, J. J., et al. Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice. Science. 355, 842-847 (2017).
- Sano, S., et al. Tet2-Mediated Clonal Hematopoiesis Accelerates Heart Failure Through a Mechanism Involving the IL-1beta/NLRP3 Inflammasome. Journal of the American College of Cardiology. 71, 875-886 (2018).
- Sano, S., Wang, Y., Walsh, K. Clonal Hematopoiesis and Its Impact on Cardiovascular Disease. Circulatory Journal. 71, 875-886 (2018).
- Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Biotechnology. 32, 941-946 (2014).
- Jiang, W., et al. An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation. Scientific Reports. 5, 13875 (2015).
- Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnology. 13, 98 (2013).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42, e168 (2014).
- Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
- Akcakaya, P., et al. In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations. Nature. 561, 416-419 (2018).
- Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30, 1473-1475 (2014).
- Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology. 36, 765-771 (2018).
- El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568, 193-197 (2019).
- Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568, 259-263 (2019).
- Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154, 442-451 (2013).
- Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152, 1173-1183 (2013).
- Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21, 440-446 (2018).
- Fuster, J. J., Walsh, K. Somatic Mutations and Clonal Hematopoiesis: Unexpected Potential New Drivers of Age-Related Cardiovascular Disease. Circulatory Research. 122, 523-532 (2018).
- Kahn, J. D., et al. PPM1D truncating mutations confer resistance to chemotherapy and sensitivity to PPM1D inhibition in hematopoietic cells. Blood. , (2018).
